论文部分内容阅读
背景:心力衰竭仍然是目前影响患者发病率和死亡率的主要原因,全球目前有近2400万患者,近5年的死亡率达到了50%左右,心肌纤维化在心力衰竭的发病机制及疾病进展中发挥了重要作用。糖酵解过程在心力衰竭和心肌梗死中的研究已较充分,但关于其在心肌纤维化中的研究较少,近期有研究表明在心脏成纤维细胞活化及心肌纤维化过程中糖酵解活性增加,但关于调控糖酵解过程中的关键蛋白酶在心肌纤维化中的作用尚未见报道。已知6-磷酸果糖-2-激酶/果糖-2,6-双磷酸酶3（PFKFB3）的代谢产物果糖-2,6-双磷酸（Fru-2,6-Bp）调控糖酵解过程中磷酸果糖激酶-1（PFK-1）的表达,而PFK-1是糖酵解过程中的重要限速酶。目前有研究表明PFKFB3可促进肝脏、肺脏成纤维细胞的活化及肺动脉平滑肌细胞的增殖,尚无关于其在心肌纤维化中作用的研究。故本研究拟从糖酵解角度阐明PFKFB3在心肌纤维化中的作用和机制,为临床上心肌纤维化及心力衰竭的治疗提供新的策略和方法。目的:1.从单细胞RNA测序角度分析心脏成纤维细胞在分化过程中糖酵解代谢水平的变化。2.明确PFKFB3在心肌纤维化中的作用;3.明确PFKFB3对心脏成纤维细胞的分化、增殖及迁移的影响;揭示PFKFB3蛋白对巨噬细胞炎症反应和迁移能力的影响。4.探索慢性心力衰竭（CHF）患者血浆PFKFB3水平与心肌纤维化的相关性,同时对血浆PFKFB3水平与CHF患者发生心血管不良事件的关系进行预测。方法:1.单细胞RNA测序生物信息学分析:注释心脏成纤维细胞亚群,分析成纤维细胞亚群代谢水平上的糖酵解通路的变化（见第一部分内容）。2.动物实验:（1）构建动物模型;（2）明确PFKFB3对心肌纤维化的作用（见第二部分内容）。3.细胞实验:（1）明确PFKFB3对心脏成纤维细胞分化、增殖及迁移的影响,探索3-（3-吡啶基）-1-（4-吡啶基）-2-丙烯-1-酮（3PO）调控心脏成纤维细胞功能的机制;（2）观察PFKFB3蛋白的胞外释放方式及对心脏肌成纤维细胞进行凋亡检测;（3）观察PFKFB3重组蛋白对心脏成纤维细胞分化的影响及对巨噬细胞炎症反应和迁移的作用（见第二部分内容）。4.临床实验:本研究通过入选住院的心衰患者作为心衰组,正常体检者为对照组,比较两组患者血浆PFKFB3浓度的差异,评价PFKFB3对心肌纤维化的诊断效能并明确其在预测心血管复合终点事件发生中的价值（见第三部分内容）。结果:1.单细胞RNA测序生物信息学分析结果:代谢通路分析表明糖酵解通路主要集中在心脏肌成纤维细胞（myo CF）中。2.动物实验结果:PFKFB3蛋白在纤维化心肌组织中明显升高,且主要表达在纤维化区域。通过3PO抑制PFKFB3的表达及基因敲除Pfkfb3会改善异丙肾上腺素诱导的及急性心肌梗死后小鼠的心脏功能及纤维化程度。3PO减轻纤维化心肌组织区域巨噬细胞的浸润和炎症反应。3.细胞实验结果:抑制PFKFB3的表达可降低心脏成纤维细胞的分化、增殖及迁移能力。3PO通过TGF-β1/HIF-1α/PFKFB3/AKT信号通路调控心脏成纤维细胞的功能;PFKFB3蛋白可能以凋亡的形式从胞内释放至胞外。PFKFB3重组蛋白诱导心脏成纤维细胞的活化,促进M0及M1型巨噬细胞分泌炎症因子,并促进M0巨噬细胞的迁移。4.临床实验结果:和对照组相比,心力衰竭组患者血浆PFKFB3水平明显升高,和心肌纤维化比值呈正相关。PFKFB3是CHF患者发生心血管复合终点事件的预测因素。结论:1.首次从人单细胞RNA测序角度分析发现心脏myo CF的代谢通路主要集中在糖酵解水平。转化生长因子β1（TGF-β1）可上调新生大鼠心脏成纤维细胞中Pfkfb3 m RNA的表达。2.在小鼠纤维化心肌组织中PFKFB3蛋白表达升高,且主要表达在纤维化区域。PFKFB3蛋白在myo CF中的表达水平显著高于其在心肌细胞中的表达。3.给予3PO干预及Pfkfb3基因敲除均可改善小鼠心肌纤维化程度和心功能,说明PFKFB3在心肌纤维化中发挥重要作用,可作为心肌纤维化治疗的靶点。4.应用3PO抑制或si RNA沉默Pfkfb3表达会减弱心脏成纤维细胞的分化,增殖和迁移能力,并能显著降低糖酵解过程产生的乳酸水平。3PO可抑制心脏成纤维细胞对胞外葡萄糖的摄取。腺病毒转染过表达Pfkfb3会促进心脏成纤维细胞的分化。3PO可通过TGF-β1/HIF-1α/PFKFB3/AKT信号通路调控心脏成纤维细胞的功能。PFKFB3介导的糖酵解在心脏成纤维细胞的分化、增殖及迁移过程中发挥重要作用。5.TGF-β1可诱导myo CF释放出PFKFB3蛋白。重组人PFKFB3蛋白介导心脏成纤维细胞的分化,并促进巨噬细胞的活化和迁移。3PO可通过抑制PFKFB3的表达减轻纤维化心肌组织中的巨噬细胞的浸润及炎症反应。6.PFKFB3在CHF患者血浆中明显升高,其水平与心脏核磁共振（CMR）测定的心肌纤维化程度呈正相关,PFKFB3是CHF患者发生心血管复合终点事件的预测因素。