人类杯状病毒(Human caliciviruses,HucV)包括诺如病毒属(NV)和札如病毒属(SV),是导致胃肠炎和病毒性腹泻的重要病毒之一。目前分离和研究较多的是NV,而SV国内基础研究资料的匮乏,给病毒的检测和疫苗的研制带来了很多困难。本课题研究工作的目的在于:构建SV原核表达载体,并以此为代表表达人类杯状病毒衣壳蛋白,同时建立环介导等温扩增技术检测方法。对认识病毒感染的本质,快速诊断,研制疫苗以及抗病毒药物提供重要的基础资料,对了解婴幼儿腹泻的发病机制及疾病的预防具有重大的指导意义。本课题包括两个部分:一是对人类杯状病毒衣壳基因序列进行人工合成、然后克隆构建原核表达载体,并表达。二是建立环介导等温扩增技术检测人类杯状病毒的方法。一、设计引物,人工合成SV衣壳基因,TA克隆后测定其核苷酸序列。将其定向克隆入pET-28a(+)载体,构建新的原核表达载体,经菌落PCR和酶切鉴定正确后,转化至大肠杆菌BL21(DE3)。通过适当的培养基组成、接种量、诱导OD值、IPTG浓度和诱导时间等因素表达SV衣壳蛋白。最后,收集菌体,破菌,离心,分离上清和包涵体。SDS-PAGE显示,目的蛋白主要以包涵体形式存在。Western-blotting结果显示,SV蛋白能够特意地与六组氨酸抗体发生免疫反应,在15kd处有一条明显的条带。二、环介导等温扩增(简称LAMP)是利用4个特殊设计的引物和具有链置换活性的DNA聚合酶,在恒温条件下特异、高效、快速地扩增DNA的新技术,电泳后在凝胶上显现出由不同大小的区带组成的阶梯式图谱。本实验建立了环介导等温扩增技术(LAMP)快速检测人类杯状病毒的方法,该方法与传统PCR方法相比,LAMP方法具有灵敏度高,特异性强,操作简便快速,不需要复杂仪器设备等优点,为临床检测腹泻病毒快速简便的新方法。