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葡糖二酸是自然界中存在的一种二元酸,在医药和聚合物等领域具有应用价值,被称为最具价值的生物炼制产品之一。葡糖二酸的生产主要依靠化学氧化法,然而化学法生产选择性不高、对环境污染较大。随着代谢工程与合成生物学的发展,代谢改造微生物生产葡糖二酸为研究者带来新思路。本研究选择模式菌株酿酒酵母,通过共表达来源于拟南芥的肌醇加氧酶miox4基因和来源于丁香假单胞菌的糖醛酸脱氢酶udh基因,在酿酒酵母细胞中构建葡糖二酸的生物合成途径。鉴于MIOX4是该途径的限速酶,而且游离型质粒表达不稳定,本研究将miox4和udh整合到酵母基因组中的高拷贝delta位点,增加基因的拷贝数,并通过补料分批发酵和发酵条件优化,葡糖二酸最高产量达到6.01 g·L-1。具体结果如下:（1）葡糖二酸合成途径游离质粒表达菌株的构建。敲除酿酒酵母中抑制肌醇积累的OPI1基因,获得BY4741opi1?菌株。构建质粒pY26-miox4-6×HIS,转入上述菌株,Western blot验证肌醇加氧酶基因miox4表达成功。然后构建质粒pY26-miox4-udh,转入BY4741opi1?,液相色谱-质谱检测到葡糖二酸的存在,高效液相色谱测定葡糖二酸的产量为0.54 g·L-1,实现了葡糖二酸在酿酒酵母中的积累;（2）整合酵母基因组的delta位点提高葡糖二酸产量。将miox4和udh通过同源重组整合到酿酒酵母基因组中的高拷贝delta位点,筛选出一株高产菌株。实时荧光定量PCR检测表明,整合delta位点表达的菌株比游离质粒表达的菌株中相应外源基因转录水平高约5倍。肌醇加氧酶活测定结果表明,整合delta位点表达比游离质粒表达的菌株中酶活更高,最高可达2050 U·mg-1,且更加稳定,同时证明肌醇对维持肌醇加氧酶的稳定性具有重要作用;（3）葡糖二酸发酵条件的优化。通过培养基成分和补料分批发酵条件的优化,最终确定葡糖二酸补料分批发酵的最适培养基和培养条件为:YPD培养基,肌醇浓度为10.8 g·L-1,在发酵进行到24、48 h分别补加5 g·L-1葡萄糖,搅拌转速为700 r·min-1,空气流量为3 L·min-1。葡糖二酸最高产量达到6.01 g·L-1。