家蚕是一种重要的经济昆虫,吐丝结茧是其主要的经济价值。家蚕从丝腺开始发育到取食桑叶转化为丝蛋白,再到丝蛋白泌出体外的整个过程都离不开基因网络的相互调控,了解调控导致的基因表达差异可以从根本上了解品种间产丝量差异,从而为提高家蚕产丝量提供可能。以高丝量品种872和低丝量品种大造5v3d丝腺为材料,通过FAIRE-seq测序数据分析,鉴定差异调控位点;利用RNA-seq鉴定差异表达基因,找出可能影响产丝量基因;最后,联合差异“峰”(“峰”等同于开放染色质区域OCR、亦等同于核小体删除区域)和差异基因,鉴定可能影响丝量差异的调控元件。1.FAIRE-seq鉴定潜在调控位点经过872和大造5v3d丝腺FAIRE-seq数据分析:首先,进行“峰”鉴定,872和大造分别鉴定到103,779和102,457个置信“峰”(开放染色质区域),占基因组比例约10%,可能由于5v3d丝腺开始大量合成丝蛋白,使得开放比例增大。进一步鉴定分析发现,872和大造品种差异“峰”分别为11,947和10,600个,共有“峰”占比90%。对TSS上下游“峰”信号的集成性分析以及“峰”长度分布统计,“峰”信号主要富集在转录起始位点上游~125bp,其长度呈现连续分布趋势,大部分在500bp以下,最长的开放染色质区域不超过3000bp。推测大量基因转录调控位点位于转录起始位点上游125bp附近。此外,通过对“峰”进行注释分析,发现很多已知的调控位点处于开放状态。例如丝蛋白编码基因fib-H,fib-L,P25和ser1,部分已经顺势作用元件已经确定,这些元件中绝大部分重合于我们鉴定到开放染色质区域,进一步证明了FAIRE-seq鉴定调控元件的可靠性。通过FAIRE-seq数据进行分析,我们成功获得了5v3d家蚕开放染色质图谱,这些图谱包含增强子,启动子及其他重要的调控元件;同时对5v3d家蚕872和大造品种的比较,获得了品种特异的调控区域或元件。2.RNA-seq鉴定丝量相关差异表达基因通过Pearson相关性分析和质量控制,在872和大造中,选择4组符合要求的数据,进行后续分析。top20高表达基因分析发现,高表达基因主要为丝蛋白、核糖体蛋白以及延伸因子等编码基因;对不同家蚕品种丝蛋白表达情况调查显示,872中丝蛋白编码基因的表达量皆高于大造;差异基因鉴定结果,共有差异基因1657个;利用kegg和go分析对差异基因进行功能注释--go注释结果,分子功能分类中,有很多基因参与蛋白的转运和转录调控;kegg富集分析,差异基因在嘌呤代谢、内质网中蛋白的加工处理、核糖体、嘧啶代谢等通路富集。通过rna-seq数据分析,我们鉴定到了丝蛋白合成和分泌相关的差异基因。3.faire-seq和rna-seq关联分析将差异基因与ocr相关联,131个差异基因在启动子区域存在特异的“峰”134个:其中,40个基因在872上游启动子区域有特异“峰”,且基因表达量872相对于大造上调,35个基因在大造启动子区域有特异“峰”,且基因表达量大造相对于872上调,我们定义其为候选正调控区域(cprrs);30个基因在872上游启动子区域有“峰”,872相对于大造基因表达量下调,29个基因大造上游有“峰”,872相对大造基因表达量下调,我们定义为候选负调控区域(cnrrs)。其中,有3个基因受到了正负调控区域的共同影响。对这些基因go富集分析发现,基因富集在分解代谢和合成代谢分类中,可能对丝蛋白质合成有重要意义。对候选的正调控区域和负调控区域影响下872和大造差异表达基因进行kegg富集分析。(1)候选负调控区域影响下,872中上调基因主要富集于糖代谢、脂类代谢等基本的物质代谢通路,以及核糖体、蛋白在内质网中的加工处理、蛋白的运输通路,而下调基因主要在信号相关通路。糖代谢、脂类代谢等基本物质代谢通路主要为丝蛋白的合成和分泌提供能量;核糖体是蛋白合成的最小场所,参与核糖体组成相关基因表达的上调能有效增加丝蛋白的合成;蛋白在内质网上加工处理及蛋白运输相关基因的高量表达,有利于丝蛋白合成。(2)候选正调控区域影响下,872上调基因特异的富集于3条免疫相关通路,比如溶酶体、nod-like受体信号通路和抗原处理与呈递,可能与872作为强健多丝品系相关,可能是872在体质上优于大造的原因。关联分析faire-seq和rna-seq数据,结合kegg富集分析结果,872上调基因对于家蚕丝产量有重要意义。4.丝量差异相关调控区域列表及motif分析我们一共获得了40个候选正调控区域和29个候选负调控区域引起872中基因表达上调,motif预测分析显示:(1)经过jaspar在线注释软件进行motif分析,根据go注释查阅其功能,67.5%候选正调控区域可以与上调基因表达的转录因子相结合。其中,存在结合hox转录因子的区域,例如br转录因子能够阻止幼虫的变态,在某种程度上延长了丝蛋白合成和分泌的时间,fkh,该因子相关报道显示,特异的在后部和中部丝腺中表达,而Ubx对丝腺的发育起着重要作用。(2)候选负调控区域motif预测,72.7%可以下调基因表达,例如CTCF抑制因子,结合区域被注释到α-1,2糖苷酶编码基因上游启动子区域,可能与糖蛋白P25基因合成有关;此外,转录抑制的gt和spl1因子,可能影响丝蛋白基因表达调控。