论文部分内容阅读
组织蛋白酶B是半胱氨酸蛋白酶超家族的重要成员，是溶酶体内重要的蛋白水解酶，广泛存在于动物﹑植物﹑微生物和人的体内。家蚕组织蛋白酶B(Bombyx mori Cathepin B, BmCatB)主要在脂肪体内合成，参与蜕皮以及幼虫-蛹的转化期的细胞程序性死亡，在昆虫生理生化和变态发育过程中起着重要的作用。但有关该基因的表达调控机制尚不清楚。本实验通过对BmCatB基因的启动子核心调控元件的分析，为进一步阐明家蚕变态发育机制提供理论依据。1. BmCatB基因启动子序列分析。提取家蚕总RNA，5’RACE确定转录起始位点，PCR克隆得到约1500bp的启动子片段。生物信息学分析表明，BmCatB基因转录起始位点位于ATG上游74bp处。该启动子内含有3个蜕皮激素响应元件（Ecdysone Response Element, EcRE），分别为EcRE1（-1035bp～-1025bp）,EcRE2（-812bp～-802bp)和EcRE3（-556bp～-546bp）；1个TATA box（-524bp～-516bp）。2. BmCatB基因启动子EcRE元件的功能分析。运用Over-lap PCR基因定点突变的方法，对该基因启动子中3个EcRE进行选择性突变，得到了7种突变方案的启动子：EM-1, EM-2, EM-3, EM-12, EM-13, EM-23和EM-123，并分别连接到双荧光质粒中，得到7个双荧光AcMNPV表达载体，检测在家蚕脂肪体中的表达活性。结果显示：EcREs突变后启动子的表达活性明显下降，提示EcREs参与了BmCatB基因启动子活性的调控，且靠近转录起始位点的EcRE3元件对其调控影响最大。3. BmCatB基因启动子未知调控元件的分析。运用5’端顺次缺失的方法，克隆得到9种不同长度的启动子片段：BF-1(-1,424bp~+33bp), BF-2(-1,283bp~+33bp), BF-3(-1,165bp~+33bp), BF-4(-1,023bp~+33bp), BF-5(-903bp~+33bp),BF-6(-761bp~+33bp), BF-7(-628bp~+33bp), BF-8(-493bp~+33bp)和BF-9(-359bp~+33bp)。将这9种不同长度启动子片段连接到双荧光质粒中，分别得到9个双荧光AcMNPV表达载体，检测在家蚕脂肪体中的表达活性。结果显示：随着启动子长度的不断缩短，其荧光素酶的活性比值呈下降趋势，其中BF-4启动子片段的荧光素酶活性比值明显下降，提示在BF-3和BF-4之间的142bp序列（-1,165bp~-1,023bp）间可能存有未知的核心转录调控元件。