镉(Cd)是一种蓄积性很强的有毒重金属,对机体多器官和多系统造成不可逆性损伤。近年来,Cd环境污染和特定职业环境暴露加剧了其对人类健康的威胁。研究发现,摄入极少量Cd,就会造成肾功能损伤。氧化应激是Cd致肾毒性的重要机制,Nrf2信号通路是调节机体氧化应激的关键信号通路之一。课题组前期研究发现,自噬增强剂海藻糖和抗氧化剂葛根素通过抑制Cd激活的Nrf2信号通路来发挥其保护效应,表明Nrf2信号通路在Cd毒性过程中具有负面效应。但目前缺乏足够的科学证据来揭示Nrf2信号通路在Cd致肾毒性中的作用。因此,本课题采用体外与体内试验相结合的研究方法,明确了Cd通过持续激活Nrf2信号通路介导肾损伤。体外试验以NRK-52E细胞系为试验材料,探讨Nrf2信号通路在Cd致肾毒性中的作用。首先,NRK-52E细胞经5μM Cd进行不同时间(0,2,4,6,8,10,12 h)处理,结果表明,Cd染毒4 h,核蛋白和胞浆蛋白组份中Nrf2蛋白水平及Nrf2基因转录水平到达峰值,之后下降;自染毒6 h至12 h,核内Nrf2蛋白水平持续升高而Nrf2基因转录水平持续下降,但胞浆内Nrf2蛋白水平无明显变化;核蛋白与胞浆蛋白组份中Keap1蛋白水平及Keap1基因转录水平呈时间依赖性下降;Nrf2的下游靶蛋白HO1和NQO1的蛋白水平和相应基因的转录水平也呈时间依赖性下降。这些研究结果证实Cd暴露导致NRK-52E细胞中Nrf2信号通路持续激活。其次,通过基因沉默技术对NRK-52E细胞进行Nrf2基因敲低,制备模型细胞进行Cd处理。采用免疫荧光染色和蛋白免疫印迹法分别检测胞内Nrf2核转位及Nrf2通路相关蛋白水平(Nrf2,Keap1,HO1和NQO1),证实成功建立了Nrf2基因敲低细胞。第三,Nrf2基因敲低细胞经Cd染毒后,通过细胞形态学观察,以及检测细胞存活率和细胞内MDA含量和ROS水平,结果证实Nrf2信号通路持续激活加剧了Cd致肾小管上皮细胞的细胞毒性和氧化应激。第四,采用蛋白免疫印迹法和GFP-LC3质粒转染法相结合的研究方法,证实Nrf2信号通路持续激活参与了Cd致自噬抑制。第五,采用两种特异性荧光探针结合激光共聚焦显微技术检测溶酶体pH,检测溶酶体膜蛋白LAMPs(LAMP1和LAMP2)蛋白水平和基因转录水平,发现Nrf2信号通路持续激活参与了Cd致溶酶体功能障碍。第六,采用免疫荧光结合共聚焦显微技术检测LAMP1和CTSD的共定位情况,发现Nrf2信号通路持续激活导致Cd致溶酶体膜通透化。第七,检测溶酶体内两种主要的蛋白水解酶(CTSB和CTSD)蛋白水平和4种水解酶编码基因(CTSB、CTSD、CTSK和CTSS)的转录水平,结合DQ-BSA染色,证实Nrf2信号通路持续激是Cd致溶酶体降解功能下降的原因。最后,采用免疫荧光和RFP-GFP-LC3串联质粒转染法相结合的研究方法,证实Nrf2信号通路持续激活参与了Cd致自噬体-溶酶体融合缺陷。体内试验以SD大鼠为试验材料,采用Nrf2抑制剂鸦胆子苦醇Bru建立动物模型,进一步证实Nrf2持续激活在Cd致肾毒性中的作用。首先,采用免疫印迹法检测大鼠肾组织中Nrf2通路相关蛋白水平(Nrf2、Keap1、HO1和NQO1),结果发现Bru有效抑制Cd致大鼠肾组织中Nrf2信号通路持续激活,表明成功建立动物模型。其次,通过检测肾组织病理损伤和血清中相关氧化指标(MDA,CAT和GPx),结果发现Bru有效缓解Cd致大鼠肾组织病理损伤和氧化损伤。第三,检测大鼠肾组织中p62和LC3蛋白水平的变化,结果发现Bru有效缓解Cd致自噬抑制。第四,采用免疫印迹法检测大鼠肾组织中溶酶体膜蛋白LAMPs(LAMP1和LAMP2)以及两种关键水解酶(CTSB和CTSD)表达水平,结果发现,Bru有效缓解Cd致溶酶体功能不良。总之,Cd暴露诱导Nrf2信号通路持续激活,参与氧化应激,加剧Cd致肾损伤。Nrf2信号持续激活的原因是Cd致细胞内Keap1耗竭和p62累积。Nrf2信号通路持续激活通过损伤溶酶体,诱导溶酶体膜通透化,破坏自噬体-溶酶体融合,影响自噬流从而加剧Cd致自噬抑制。本研究结果将为Cd的肾毒性机制研究开拓新的思路,为从Nrf2信号通路角度防控Cd致肾毒性提供全新的理论依据。