干扰素调节因子（interferon regulatory factor,IRF）是一类在干扰素（interferon,IFN）信号通路中起重要调节作用的转录因子,能在干扰素的产生和信号传导等方面发挥多种作用。在哺乳动物中,IFN-Ⅰ的作用可以通过包括JAK-STAT（Janus kinase-signal transducer and activator of transcription）通路在内的多种转录因子实现,从而实现在病毒感染早期对病毒复制的抑制能力。其中,由STAT1、STAT2和负责与DNA结合的IRF9组成的ISGF3复合体扮演了重要的角色。研究证明IRF9存在依赖于IFN-Ⅰ的正反馈调节,实验与临床证据证明IRF9缺失的人或动物表现出持续的病毒感染。能否通过对IRF9的敲除构建IRF9缺失的细胞系,为病毒分离和增殖提供可靠的工具?IRF9的缺失对干扰素调节作用和病毒感染产生怎样的影响?这是本研究拟解决的科学问题。本实验使用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建IRF9基因稳定敲除的BHK21细胞系。构建e Sp Cas9-Lenti CRISPR v2敲除质粒,经嘌呤霉素筛选获得多克隆细胞系,经T7E1酶切鉴定选取基因编辑效率较高且生长稳定的多克隆细胞,然后通过有限稀释法获得IRF9-/-单克隆细胞株。为验证IRF9敲除细胞系是否构建成功,分别检测并比较了VSV（Vesicular stomatitis virus）、RV（Rotavirus）、PDCo V（Porcine deltacoronavirus）、PCV2（Porcine circovirus）等病毒感染后的增殖情况。此外为验证IRF9缺失对IFN-Ⅰ信号通路的影响,利用q PCR检测了部分IFN诱导基因（IFN-stimulated gene,ISG）的表达。最后为进一步确定上述影响是由于IRF9的缺失造成,通过构建pc DNA-IRF9重组质粒对IRF9进行过表达来实现IRF9的回补。实验结果表明,e Sp Cas9-Lenti CRISPR v2敲除质粒对细胞的CRISPR打靶经T7E1酶切验证对IRF9的基因编辑效果显著。获取单克隆细胞并进行测序的验证结果表明单克隆细胞株实现了对IRF9基因的敲除,获得了稳定敲除IRF9的细胞系。荧光显微镜观察、q PCR、流式细胞术结果显示,敲除细胞对VSV的易感性显著提高、对RV的易感性极显著提高、对PDCo V的易感性显著提高,对PCV2获得了短期的感染能力,对于不能感染的病毒的易感性没有显著变化;敲除细胞对ISG的表达出现了明显下降,且能被IFN-Ⅰ的刺激和IRF9的回补部分地弥补。综上所述,本实验利用CRISPR技术构建了IRF9敲除细胞系,表现出对能感染病毒易感性的显著提升与ISG响应IFN-Ⅰ能力的显著下降,为实验室病毒分离和增殖提供了工具,也为进一步深入研究IRF9基因的功能与机制奠定了基础。