背景和目的原发性肝癌已经成为严重危害人类生存的重要疾病之一。目前肝癌的治疗以手术为主的综合治疗，而化疗在综合治疗中仍有很大需求，尤其是出现肺、骨等脏器的转移，此时局部治疗难以起到良好效果、化疗将是很有需求的治疗手段。5-氟尿嘧啶（5-FU）虽已用于多种肿瘤，但全身应用对肝癌有效率仅约15％，且有诸多副作用。卡培他滨(capecitabine，商品名：希罗达Xeloda)是一新型的氟尿嘧啶前体药，具有口服吸收迅速，在肿瘤内优先转化为5-FU的特点，较直接静脉应用5-FU相比，具有更强的肿瘤选择性和更少、更轻的副作用。已被美国FDA批准用于紫杉醇耐药的乳腺癌临床治疗。我所周俭等研究表明，卡培他滨具有抑制高转移人肝癌裸鼠模型LCI-D20原位移植瘤的生长、转移及切除术后转移复发的作用。卡培他滨本身无细胞毒作用，需在体内经过多步酶解反应才能生成有化疗作用的5-FU。其中胸苷磷酸化酶（thymidine phsphorylase,TP）是发挥作用的关键限速酶。TP能在肿瘤组织内催化5(-脱氧-5-氟尿苷（5(-dFUrd）、卡培他滨等5-FU的前体药转化为有细胞毒作用的5-FU。TP在多种肿瘤组织中表达水平均高于周围正常组织，因此卡培他滨可以优先在肿瘤内部转化为5-FU。我所周俭等研究还表明，门静脉癌栓、肝癌组织及癌旁肝组织中血小板衍化内皮细胞生长因子（PD-ECGF，与TP同源） mRNA表达率分别为77.8％、67.9％和35.7％。另有报道，TP在肝癌中表达的阳性率为51.9％，在Edmondson分级III-IV级或伴有门静脉癌栓的肝癌中TP表达水平较高。另一方面，在生理条件下，肝细胞中TP表达较高，肝癌组织与周围肝组织相比，TP表达水平差异不大，正常肝组织为143.5±72.1μg 5-FU/mg protein/hr，而肝癌组织为159.2±91.7μg 5-FU/mg protein/hr，远低于在子宫颈癌、乳腺癌，结、直肠癌等肿瘤组织与其相应正常组织之间的比值。为此，如何进一步提高肝癌组织中TP表达水平，以增加5-FU前体药敏感性具有重要意义。提高肿瘤组织中TP表达水平的主要方法包括转染TP cDNA，以提高肿瘤细胞TP表达水平，但受转染效率、表达载体及给药途径等限制尚不能应用于临床。其它调节TP表达水平的方法还有联合应用其它化疗药和细胞因子。已有研究表明，联合应用丝裂霉素、泰索帝、紫杉醇、环磷酰胺等能提高肿瘤中TP表达水平和活性。多种细胞因子如IL-1α、TNF-α、IFN-γ、bFGF、PD-GF也能上调TP表达或活性，IL-12能通过上调IFNγ而起到间接上调TP表达的作用。TP与PD-ECGF具有同源的氨基酸序列，体外能诱导内皮细胞移动，体内有促进<WP=5>血管生成的活性。TP促血管生成活性与其酶促活性密切相关。TP表达上调后，可能因其促进血管生成能力增强而导致肿瘤转移潜能增加。已有报道，PD-ECGF/TP高水平表达与肿瘤转移及预后不良正相关。如何解决这一对矛盾，即上调TP表达水平提高肝癌对氟尿嘧啶前体药的敏感性与TP表达上调后促进肝癌血管生成能力增加而致转移潜能增强之间的矛盾，是需要解决的问题。干扰素－α(IFN-α)是I型干扰素，具有抗病毒感染，促进细胞分化，调节细胞增殖和免疫等多种功能，近年又发现IFN-α能上调肿瘤组织或细胞中TP表达或活性，而我所王鲁等发现，在大剂量时又具有抑制肿瘤新生血管形成的作用。临床研究表明，联合应用干扰素-α与氟尿嘧啶类药物及其它化疗药，可使部分不能切除的肝癌病人获得临床治愈的可能。因此本课题拟研究转染TP cDNA与应用干扰素-α两种途径调节肝癌细胞TP表达的可行性，以及TP表达改变后对细胞凋亡、诱导内皮细胞移动能力及药物敏感性的变化，以期寻找合适的IFN-α剂量，达到既能上调TP表达提高肝癌对氟尿嘧啶前体药的敏感性，又能抑制TP表达上调后诱导血管生成增强的不良作用。方 法TP cDNA原核表达载体pBluescrip-TP酶切、胶回收，目的片段与pcDNA3.1/zeo(+)质粒酶切产物进行连接反应，阳性反应克隆（pcDNA3.1-TP）进行转化、扩增。利用RT-PCR方法检测不同细胞TP mRNA表达水平。将pcDNA3.1-TP转染肝癌细胞SMMC-7721，经zeocin筛选获得的阳性细胞克隆并检测其TP mRNA表达水平，免疫细胞化学方法检测TP蛋白质的表达，生长曲线法检测其增殖活性，流式细胞仪检测其凋亡，Boydern Chamber小室法检测侵袭和诱导内皮细胞移动的潜能，MTT法检测药物敏感性。干扰素-α处理SMMC-7721、L02细胞，观察对TP mRNA表达水平及凋亡的影响，同时观察对SMMC-7721细胞诱导内皮细胞移动能力的影响；将30只荷SMMC-7721裸鼠分为5组，给予不同剂量的干扰素-α，利用酶联免疫吸附法（ELISA）检测肿瘤组织中TP蛋白水平，利用抗CD34免疫组化方法检测肿瘤组织中微血管密度（MVD）。将36只人肝癌高转移裸鼠模型LCI-D20，分别给予低剂量干扰素-α、5-FU、卡培他滨及联合用药，观察对原位瘤体积、血常规和血生化的影响。再将30只LCI-D20分别给予高剂量干扰素-α、卡培他滨及联合用药，观察对原位瘤体积、血常规和血生化的影响，ELISA方法检测肿瘤组织中TP蛋白表达水平。结 果一、转染TP cDNA后细胞TP表达水平和生物学行为的改变与亲代SMMC-7721表达水平相比（0.49±0.02），转染TP cDN