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研究目的病毒性肺炎是流感病毒感染后最严重的并发症,可能导致呼吸窘迫综合征,甚至死亡,目前尚无令人满意的治疗方法。病毒性肺炎的发病机制尚不完全清楚,目前认为致病机理除病毒侵入后对呼吸器官及组织产生的直接损伤外,其主要原因是流感病毒会激活肺组织的各种炎症细胞和导致促炎因子的释放,机体与侵入病毒相互作用发生过度炎症反应而造成免疫损伤。肺部炎症反应的关键细胞是肺泡巨噬细胞,在感染过程中产生过量炎症因子。近年来,氧化应激和NLRP3炎性体成为研究热点。细胞内活性氧(ROS)的产生是NLRP3炎性体活化的重要因素之一,一方面ROS可以增加NF-κB的产生,从而促进Pro-IL-1β和Pro-IL-18的产生,增强NLRP3炎性体活化的第一信号;另一方面ROS可以通过增加Arrb1(β-arrestin1)和TXNIP(硫氧还蛋白相互作用蛋白)而促进NLRP3的寡聚化而活化,增强炎性体活化的第二信号,使Caspase-1活化,最终将Pro-IL-1β和Pro-IL-18剪切成为成熟的IL-1β和IL-18炎症因子,分泌到胞外发生炎症反应。小檗碱(黄连素)是一种从中药黄连、黄柏等提取的古老的生物碱药物,有显著的抗炎作用。有研究表明,小檗碱通过抑制ROS水平来抑制氧化应激反应。我们的前期研究表明小檗碱对小鼠流感病毒肺炎有治疗作用,对NLRP3炎性体的活性有抑制作用。因此,本研究以流感病毒感染小鼠RAW264.7巨噬细胞为模型,研究小檗碱是否通过ROS途径抑制NLRP3炎性体的活化及其可能机制,为进一步阐明小檗碱抑制流感病毒诱发的炎症反应的分子机制提供理论和实验依据。研究方法1.构建流感病毒PR8感染小鼠RAW264.7巨噬细胞的模型,将细胞分为正常对照组(0h)和病毒分别感染2h、4h、6h、12h、24h及48h等6组模型组。通过免疫细胞化学染色方法,观察流感病毒PR8感染不同时间点巨噬细胞中流感病毒核蛋白(NP)的表达情况。2.将细胞分为正常对照组(0h)和病毒分别感染2h、4h、6h、12h、24h及48h等6组模型组,收集细胞,通过Trizol法提取细胞的RNA,用Real-time PCR法检测流感病毒感染不同时间点的巨噬细胞中病毒NP以及Pro-Caspase-1的mRNA表达水平。3.将巨噬细胞分为正常组、病毒组、病毒+小檗碱组、病毒+ROS清除剂(NAC)组、病毒+NAC+小檗碱组、病毒+ROS激活剂组(XO)组和病毒+XO+小檗碱组,干预因素作用24h。用流式细胞术检测巨噬细胞中ROS的含量,用Caspase-1活性检测试剂盒检测巨噬细胞中Caspase-1酶活性,用ELISA法检测巨噬细胞分泌的IL-1β含量。4.将巨噬细胞分为正常组、病毒组、病毒+小檗碱组、病毒+XO组和病毒+XO+小檗碱组,干预因素作用24h。用Real-time PCR法检测巨噬细胞内NF-κB、Pro-IL-1β、Pro-IL-18、NLRP3、Pro-Caspase-1、Arrb1 和 TXNIP mRNA 的表达水平。研究结果1.流感病毒感染巨噬细胞不同时间后,镜下观察感染6h到24h的细胞中病毒NP表达较多,细胞感染率较高。2.流感病毒感染巨噬细胞后,病毒NP与炎症反应关键因子Pro-Caspase-1均在感染6h和24h时表达最高。说明感染6h和24h时病毒复制率最高。3.与正常组相比,病毒组ROS含量明显升高,加小檗碱后明显降低;病毒加NAC(ROS清除剂)组ROS产生明显下降,加小檗碱后进一步下降;病毒加XO(ROS激活剂)组ROS产生明显升高,加小檗碱后下降。4.与正常组相比,病毒组Caspase-1酶活性升高,是正常组的1.22倍;小檗碱干预组比病毒组明显降低,是病毒组的0.5倍;病毒加NAC组明显降低,加小檗碱后是病毒加NAC组的0.51倍;病毒加XO组明显升高,加小檗碱后是病毒加XO组的0.26倍。5.与正常组相比,病毒组IL-1β含量升高,加小檗碱后明显降低,是病毒组的0.72倍;病毒加NAC组IL-1β分泌减少,加小檗碱后进一步减少;病毒加XO组IL-1β分泌增多,加小檗碱后明显减少。6.与正常组相比,病毒组 NF-κB、Pro-IL-1β、Pro-IL-18、NLRP3、Pro-Caspase-1、Arrb1和TXNIP的mRNA转录水平均明显升高,除TXNIP外,其余基因mRNA转录水平在加小檗碱后均明显降低;病毒加XO组以上基因mRNA转录水平均明显升高,小檗碱干预后降低。研究结论研究结果表明,小檗碱抑制流感病毒感染巨噬细胞诱导的炎症反应的机制,可能是通过抑制ROS的释放,一方面减少NF-κB的产生,进而减少Pro-IL-1β、Pro-IL-18的产生,抑制NLRP3炎性体活化的第一信号;另一方面通过减少Arrb1的产生,从而阻碍了 NLRP3的寡聚化,抑制NLRP3炎性体活化的第二信号;进而使Caspase-1活性分子减少,最终减少炎症因子IL-1β和IL-18的释放,从而抑制了炎症反应。