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共轭亚油酸(Conjugated linoleic acid,CLA)是一类含有共轭双键的十八碳二烯酸,有众多异构体。研究表明CLA具有抗癌、减肥、抗炎等多种生理功能。但不同的CLA异构体功能有所差异,甚至具有相反的功能。为了满足CLA在医药及营养领域的应用要求,获得CLA单体非常重要。近年来,通过生物合成法生产单一、安全的CLA受到了极大的关注。高山被孢霉(Mortierella alpina,M.alpina)作为一种高产脂的微生物,总脂最高可达细胞干重的50%。高山被孢霉本身不能合成CLA,但其亚油酸(Linoleic acid,LA)含量丰富,占总脂的10%左右,可作为亚油酸异构酶的潜在底物。本实验室前期也成功将亚油酸异构酶PAI在高山被孢霉中进行了表达,但重组菌中CLA生成量较低,通过研究进一步证实了游离态LA的不足是限制高山被孢霉重组菌中CLA生成的主要因素。而硫酯酶是调节脂肪酸碳链延长和合成的关键酶,它能催化酰基-CoA硫酯键的水解,产生游离态的脂肪酸。硫酯酶的引入能使高山被孢霉内亚油酸的存在形式受到调控,使甘三酯态的LA更多的向游离态形式转变,理论上亚油酸异构酶可在硫酯酶的协同作用下生成CLA。所以本研究首先考察了硫酯酶对高山被孢霉脂质合成代谢的影响,并通过共表达硫酯酶和亚油酸异构酶来进一步研究其对高山被孢霉合成CLA的作用。本课题主要结果如下:1.高山被孢霉中硫酯酶基因转录水平的研究。选取高山被孢霉氮源耗尽前后的时间点(A:8 h,B:18 h,E:19.5 h,K:21 h,L:32 h,M:68 h)进行取样,通过RT-qPCR对硫酯酶基因的转录水平进行分析。结果显示ACOT8I基因的转录水平在脂质积累初期显著增高,最高可达B点转录量的7倍;而其他硫酯酶(ACOT8II、ACOT9I、ACOT9II在整个脂质积累期转录水平变化不显著。据此,我们推测ACOT8I的表达与高山被孢霉内脂肪酸的代谢具有较高的相关性。2.高山被孢霉内过表达硫酯酶ACOT8I对其脂肪酸组成的影响。通过对高山被孢霉重组菌的脂肪酸组成分析,结果显示其脂肪酸组成与野生型高山被孢霉保持一致。后又通过薄层色谱对不同形式的脂肪酸进行分离,分析发现重组菌中游离脂肪酸的总含量从0.9%增加到了2.8%。其中游离态总脂肪酸中亚油酸占了9%,而对照菌株中仅占1.3%。这表明硫酯酶ACOT8I的过表达可以增强酰基-CoA到游离态脂肪酸的转化,增加重组菌中游离态亚油酸的含量,对高山被孢霉中脂肪酸的代谢起着重要的调节作用。3.硫酯酶和亚油酸异构酶共表达的高山被孢霉重组菌中,硫酯酶对其产CLA影响的研究。首先采用同源重组克隆的方式获得硫酯酶和亚油酸异构酶基因的共表达载体,并通过根癌农杆菌介导转化法获得了高山被孢霉重组菌。通过对共表达高山被孢霉重组菌脂质组成和转录水平的分析,发现硫酯酶的过表达并没有明显促进重组菌合成CLA。