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目的通过构建猪CFL2基因真核表达sh RNA重组体,并转染小鼠成肌细胞C2C12,获得稳定低表达CFL2的细胞株,进而研究CFL2基因低表达对肌纤维各组成成分及细胞信号通路关键因子的影响,初步了解其分子作用机制,为进一步研究CFL2的功能提供参考。方法采用RNAi技术,将猪CFL2基因真核表达sh RNA重组体稳定转染至小鼠成肌细胞C2C12中,采用实时定量PCR技术和Western blot方法分析低表达CFL2基因后成肌细胞C2C12中的肌纤维组成成分(MLC、α-actin、My HC2b、My HC2x、My HC2a和My HC slow)和信号通路关键成分(MEF2C、sk MLCK、Rho A、AMPKα2、p38和Ca M)的m RNA和蛋白质的表达情况。结果1、成功构建针对CFL2基因的3个不同CFL2-sh RNA重组体。2、将3个sh RNA重组质粒分别稳定转染至小鼠成肌细胞C2C12中,通过实时定量PCR和Western blot检测确定稳转细胞株中CFL2的m RNA及蛋白质均受到不同程度的抑制。3、实时定量PCR方法分析CFL2稳定干扰组的结果表明:肌纤维组成成分MLC的m RNA表达显著上调(p<0.05);信号通路关键成分MEF2C、Ca M、p38和AMPKα2均极显著下调(p<0.01),sk MLCK的表达极显著上调(p<0.01);决定肌纤维类型的My HCslow、My HC2a和My HC2x的表达均极显著下调(p<0.01)。4、Western blot方法分析CFL2稳定干扰组的结果表明:3个稳转细胞株中仅1组样品(CFL2抑制率最高组)的MLC和α-actin的蛋白表达量极显著升高(p<0.01),My HC2b、My HC2a和My HC2x蛋白表达极显著下调(p<0.01);而信号通路关键成分MEF2C和Ca M的蛋白表达在3个稳转细胞株中均显著或极显著下调(p<0.05或p<0.01),其他4种成分(p38、Rho A、AMPKα2和sk MLCK)均差异不显著(p>0.05)。5、统计学分析表明:CFL2与α-actin、MLC、MEF2C、Ca M、sk MLCK、My HC2b、My HC2a和My HC2x分别呈显著或极显著正或负相关关系(p<0.05或p<0.01)。结论1、CFL2低表达引起细胞内肌球蛋白重链My HC2b、My HC2a和My HC 2x的极显著下调;而肌纤维其它成分α-actin和MLC仅在CFL2极度低表达时极显著升高。2、CFL2低表达显著下调信号通路关键成分MEF2C和Ca M的表达。3、CFL2与My HC2b、My HC2a、My HC2x、α-actin、MLC、MEF2C、Ca M和sk MLCK分别呈显著正或负相关。