一、研究背景:结直肠癌(Colorectal cancer,CRC)是最常见的消化道恶性肿瘤之一,在我国其发病率和死亡率呈逐年上升趋势。结肠癌的发生、发展机制不明是目前防治的主要瓶颈,并且由耐药引起的复发和转移是导致结肠癌患者治疗失败及影响预后的重要原因。因此,深入研究促进结肠癌发生发展的关键分子及调控机制,寻找到逆转耐药和化疗增敏的新靶点,对降低结肠癌的发病率,实现个体化精准治疗,提高患者生存质量具有十分重要的意义。自噬(Autophagy)又称为II型程序性细胞死亡(Type II programed cell death),指细胞通过消化自身某些多余的细胞器,获得存活所需的营养和能量物质的生物学过程。自噬过程在进化上趋于保守,是各类细胞在应激状况下氨基酸、核酸等生物大分子物质的主要来源。细胞自噬反应的机体内环境“动态平衡”是维护细胞生存稳态的重要保障,与细胞生长、个体发育及多种疾病发生密切相关。自噬功能缺陷可导致细胞DNA损伤,增加基因组不稳定性,进而触发细胞凋亡、老化、周期阻滞、导致肿瘤发生及药物抵抗等。在肿瘤的演变过程中,自噬更是具有双刃剑效应,一方面在肿瘤发生早期通过防止致癌物质及损伤累积抑制肿瘤发生,另一方面,在肿瘤形成后通过为肿瘤细胞适应环境提供能源储备促进肿瘤进展。目前,已有较多证据表明,有效的调控细胞自噬稳态,是防治肿瘤发生发展及促进化疗增敏的关键,但目前对于肿瘤自噬的调控机制仍不十分清楚。代谢重编程是恶性肿瘤的重要特征,肿瘤发生发展过程中伴随多种代谢相关基因的表达及活性异常。脂代谢相关基因含自水解酶域蛋白5(Abhydrolase domain containing 5,ABHD5)是体内甘油三酯水解过程中的重要辅酶,其本身虽不具有脂肪酶的活性,但它可通过激活甘油三酯脂肪酶调控脂肪组织和非脂肪组织中的脂肪分解代谢过程。既往有研究表明,该基因在结肠癌中发挥重要的抑癌作用,但其调控肿瘤发生的具体机制尚不清楚。已知自噬即参与细胞代谢平衡的调控也在肿瘤发生发展过程中扮演重要角色,但在肿瘤发生及药物抵抗过程中代谢相关基因的表达及活性异常是否参与了肿瘤细胞自噬水平的调控尚不明确。我们研究发现,ABHD5基因缺失可导致的细胞自噬水平降低,推测ABHD5介导的自噬改变是促进结肠癌发生发展的重要原因,并深入进一步探索了ABHD5与Beclin1相互作用调控自噬的分子机制,证实了该基因在结肠癌发生及5-FU化疗耐受中的作用。二、目的:1、明确ABHD5调控细胞自噬介导结肠癌发生发展的作用及分子机制。2、研究ABHD5在结肠癌患者预后和5-FU化疗疗效评价中的预测价值。三、材料和方法:1、利用CRISPR/Cas9技术建立ABHD5敲除的CCD841Co N,FHC结肠上皮细胞系,基因敲除技术构建肠道特异性ABHD5敲基因APCmin/+小鼠,结合数据库分析,彗星实验,染色质稳定性检测,ABHD5代谢活性位点突变等方法,验证ABHD5介导细胞自噬改变调控结肠上皮细胞染色质稳定性改变及肿瘤发生的作用。2、利用人结肠上皮细胞CCD841CoN,FHC为模型,结合免疫荧光,Co IP,GST-pull down等实验方法,阐明ABHD5与Caspase3竞争自噬关键蛋白Beclin1的剪切位点调控细胞自噬水平的分子机制。3、基于慢病毒载体构建ABHD5高低表达的结肠癌细胞系,结合高效液相色谱法,代谢组学分析检测,核素标记的14C-FU示踪等方法探索ABHD5调控自噬相关尿嘧啶合成介导5-FU耐药的作用及机制。4、利用Gene Expression Omnibus数据库中GES29582,GES17536两个数据集中的全基因表达谱及临床资料构建发现集,结合由我院收治的222例结肠癌患者组成的验证集,分析Ⅱ/Ⅲ期结肠癌ABHD5基因表达与5-FU辅助化疗疗效的关系。四、研究结果:1、ABHD5缺失导致正常结肠上皮细胞和腺瘤细胞自噬水平显著降低、DNA修复能力减弱、基因组不稳定性明显增强,促进肿瘤发生;在肠道特异性敲除ABHD5的APCmin/+肠道腺瘤小鼠模型中,ABHD5缺失可通过抑制细胞自噬反应促进腺瘤癌变。2、ABHD5可与Caspase3竞争自噬关键蛋白Beclin1的ASP124,ASP133,ASP149三个剪切位点,并以此调控Beclin1的剪切活性介导细胞自噬水平改变。结肠上皮细胞由于ABHD5基因缺失,促进Caspase3与Beclin1的结合,上调Beclin1剪切活性,导致Beclin1被剪切为N端片段与C端片段,失去诱导细胞自噬的能力,促进肿瘤发生。利用Beclin1的特异性激动剂上调Beclin1诱导细胞自噬的活性,可在小鼠体内回复ABHD5缺失后的促肿瘤发生效应。3、ABHD5基因缺失导致细胞自噬相关尿嘧啶补救合成途径受损,内源性嘧啶合成减少,当给予5-FU处理时,细胞误将5-氟尿嘧啶作为DNA合成底物大量摄取进入细胞,上调结肠癌细胞对5-FU的药物敏感性,促进细胞死亡。4、人结肠癌组织中ABHD5表达与Ⅱ/Ⅲ期结肠癌患者5-FU辅助化疗疗效具有相关性。ABHD5缺失的患者预后较差,但该类患者可从5-FU辅助化疗中获益,而ABHD5高表达的患者其本身预后较好,经5-FU辅助化疗后DFS却明显缩短。五、结论:1、ABHD5缺失导致正常结肠上皮细胞和腺瘤细胞自噬水平显著降低、DNA修复能力减弱、染色体不稳定性显著增强,促进结肠癌发生。2、ABHD5可竞争性结合Beclin1的Caspase3剪切位点,通过非PNPLA2依赖的代谢途径调控Beclin1介导的细胞自噬水平改变。3、ABHD5通过调控自噬相关嘧啶代谢重编程影响结肠癌细胞对5-FU药物敏感性。4、ABHD5可作为Ⅱ/Ⅲ期结肠癌患者5-FU辅助化疗的疗效预测指标。