研究背景：膀胱肿瘤是我国泌尿系统中最常见的恶性肿瘤，且发病率呈不断增高趋势。临床上约70%-80%左右的初发膀胱肿瘤为非肌层浸润性肿瘤，经尿道膀胱肿瘤电切术（Trans-urethral Resection of Bladder Tumor，TUR-BT）则是较常用的手术方法，但术后5年肿瘤复发率高达60%-70%，且有10%-25%的膀胱肿瘤患者经一次或多次复发后，恶性度逐渐增高，并可能发展成为肌层浸润性膀胱肿瘤，严重影响着膀胱肿瘤患者的治疗效果及预后。目前预防非肌层浸润性膀胱肿瘤术后复发及向恶性进展的可能有效办法之一就是TURBt术后辅以膀胱灌注化疗药物或免疫制剂。但无论是常用化疗药物（吡柔比星、丝裂霉素C等）、生物免疫制剂（卡介苗等）还是两者联合使用，虽然近期均有一定的疗效，但远期仍有22.7%-26.2%的患者存在复发；且两种灌注方法都可能存在不同程度的骨髓抑制、过敏反应及膀胱刺激征等全身或局部毒副作用。鉴于目前膀胱灌注药物的疗效不稳定性及毒副作用，寻找一种更有效且更安全的新型膀胱灌注药物仍是膀胱肿瘤治疗方面研究的重点。水飞蓟宾（Silibinin）作为一种传统保肝药物在临床上已经被广泛应用于治疗慢性肝炎、肝硬化及中毒性肝损害等疾病。近年来的研究则发现，水飞蓟宾具有广谱抗肿瘤作用。自Agarwal R等1999年在PNAS杂志（美国科学院院报）上首次报道了水飞蓟宾可以发挥抗前列腺癌效果后，先后有多个研究小组均发现了水飞蓟宾可以显著抑制结肠癌、胃癌、肺癌、乳腺癌、肝癌、卵巢癌及皮肤癌等多种肿瘤的生长，提示了水飞蓟宾作为新型抗肿瘤药物的潜在可能性。对于水飞蓟宾抑制多种肿瘤的分子机制，目前认为可能与通过阻滞肿瘤细胞周期，诱导凋亡，抑制血管生成，逆转多药耐药及抑制侵袭转移等途径有关。其中，肿瘤细胞的凋亡诱导是肿瘤化疗中至关重要的机制之一，也是评价化疗药物疗效的重要指标之一，因此，凋亡诱导作用及凋亡相关信号通路（包括外源性细胞膜受体及内源性线粒体凋亡信号通路）的参与在水飞蓟宾的抗肿瘤机制中逐渐受到研究者的关注。在膀胱肿瘤RT4、T24及TCCSUP细胞中，有研究报道水飞蓟宾可以诱导其发生凋亡并抑制其体内外增殖能力，提示了水飞蓟宾在膀胱肿瘤的药物治疗中的潜在前景。但是，对于外源性及内源性凋亡信号通路在水飞蓟宾所诱导的凋亡过程中的作用未进行充分的探讨及研究，换言之，水飞蓟宾诱导膀胱肿瘤细胞发生凋亡的确切分子机制仍不甚清楚；此外，在以上研究所采用的细胞系中，从细胞的来源及恶性程度来说，膀胱癌RT4细胞代表分化良好的乳头状尿路上皮癌，T24细胞代表浸润性膀胱癌、TCCSUP细胞则代表高级别高浸润性膀胱癌，而临床上膀胱肿瘤的类型以非肌层浸润性膀胱癌最为常见，高复发性是这类肿瘤的特点之一，因此这些细胞均未能很好的代表浅表性（非肌层浸润性）膀胱癌特别是高危浅表性膀胱癌细胞的特征，无法很好的模拟临床；最重要的是，这些研究在体内实验部分均局限在通过口服给药途径给予水飞蓟宾对膀胱肿瘤进行干预，而对于膀胱灌注水飞蓟宾的可能性则未涉及，对于膀胱灌注水飞蓟宾对膀胱肿瘤的影响尚未见任何报道。研究目的：1.以膀胱癌5637细胞系（代表高危浅表性膀胱癌）为研究对象，辅以建立裸鼠皮下移植瘤模型，围绕线粒体及线粒体内相关凋亡分子的功能，探讨水飞蓟宾诱导膀胱癌5637细胞凋亡的相关分子机制；2.以膀胱灌注N-甲基亚硝基脲（MNU）诱导大鼠原位膀胱肿瘤为体内动物研究模型，探讨膀胱灌注水飞蓟宾对于膀胱肿瘤的影响，为进一步将水飞蓟宾作为膀胱肿瘤术后膀胱灌注化疗新的选择方案奠定重要的理论及实验依据。研究方法：1.采用MTT法观察水飞蓟宾对膀胱癌5637细胞增殖的影响；应用TUNEL法及Annexin V-FITC/PI标记后应用流式细胞术检测水飞蓟宾对膀胱癌5637细胞凋亡的影响。2.通过分光光度法检测水飞蓟宾干预后caspase-3及caspase-9的活化程度；使用Western Blot法检测水飞蓟宾干预后cleaved caspase-3、cleaved caspase-8、cleavedcaspase-9、PARP及survivin的表达情况；应用流式细胞术及TUNEL法检测广谱caspase抑制剂z-VAD-fmk预处理对水飞蓟宾所诱导的膀胱癌5637细胞凋亡的影响。3.采用JC-1标记后应用流式细胞术检测水飞蓟宾对膀胱癌5637细胞线粒体膜电位的影响；提取水飞蓟宾干预后膀胱癌细胞质、线粒体、细胞核蛋白及总蛋白，采用Western Blot检测AIF、Cyto C、Smac/DIABLO、HtrA2/Omi的亚细胞定位情况；应用免疫荧光技术观察水飞蓟宾对膀胱癌细胞AIF核转位的影响。4.观察口服不同剂量水飞蓟宾对人膀胱癌裸鼠皮下移植瘤生长的影响，记录口服水飞蓟宾对裸鼠体重、瘤重及饮食量的影响；采用TUNEL法检测移植瘤细胞凋亡发生的情况；应用免疫组织化学染色及Western Blot法检测水飞蓟宾对移植瘤细胞内Cleaved Caspase-3、Survivin、AIF等凋亡相关蛋白的影响。5.通过膀胱灌注MNU诱导大鼠原位膀胱肿瘤，观察早期（第一周）及晚期（第八周）膀胱灌注不同剂量水飞蓟宾对MNU所诱导的大鼠膀胱肿瘤发生及发展的影响；记录及测量膀胱灌注水飞蓟宾对大鼠体重、膀胱总重量及饮食量的影响；采用TUNEL法检测大鼠膀胱癌细胞凋亡发生的情况。结果：1. MTT结果显示水飞蓟宾可通过剂量及时间依赖性的方式抑制膀胱癌5637细胞的体外生长；流式细胞术及TUNEL染色结果提示水飞蓟宾还可以诱导膀胱癌5637细胞发生凋亡。2.水飞蓟宾可显著激活caspase-3、caspase-8、caspase-9及PARP的活化，并下调凋亡抑制因子survivin的表达，但广谱caspase抑制剂z-VAD-fmk不能完全抑制及逆转水飞蓟宾所诱导的膀胱癌细胞凋亡。3. JC-1标记线粒体后采用流式细胞术检测可发现水飞蓟宾可通过剂量依赖的方式诱导膀胱癌5637细胞线粒体膜电位发生去极化，增加线粒体膜电位崩溃的阳性细胞数；广谱caspase抑制剂z-VAD-fmk不能抑制水飞蓟宾所诱导的线粒体膜电位的下降；Western Blot结果则提示了水飞蓟宾可以显著增加细胞质内Cyto C、AIF以及HtrA2/Omi的表达水平，下调线粒体内Cyto C、AIF以及HtrA2/Omi的表达，但对Smac/DIABLO的亚细胞定位无明显影响，提示水飞蓟宾干预后可引起膀胱癌5637细胞线粒体内Cyto C、AIF以及HtrA2/Omi的释放；此外，水飞蓟宾对膀胱癌5637细胞的总蛋白中Cyto C、AIF、Smac/DIABLO以及HtrA2/Omi的表达均无明显影响。4. Western Blot结果表明水飞蓟宾可以增加5637细胞核内AIF的表达水平；免疫荧光标记AIF则发现了水飞蓟宾干预后AIF转位至细胞核明显增加，证实了水飞蓟宾广谱caspase抑制剂z-VAD-fmk不能抑制水飞蓟宾所诱导的AIF核转位。5.口服水飞蓟宾可显著抑制裸鼠膀胱癌皮下移植瘤的生长；口服水飞蓟宾对裸鼠的体重、饮食及一般情况未产生影响；TUNEL染色证明了水飞蓟宾可以引起移植瘤细胞发生凋亡；免疫组织化学染色结果表明水飞蓟宾可以上调移植瘤内CleavedCaspase-3的表达、下调survivin的表达并增加AIF在细胞核内的表达；Western Blot结果也证实了水飞蓟宾可上调Cleaved Caspase-3及AIF的表达并下调survivin的表达。6.早期（第一周）及晚期（第八周）膀胱灌注水飞蓟宾均可显著降低膀胱灌注MNU所诱导的大鼠发生非肌层浸润性膀胱癌及肌层浸润性膀胱癌的比例；TUNEL染色证实了水飞蓟宾可以引起大鼠膀胱癌细胞发生凋亡；膀胱灌注水飞蓟宾对大鼠的体重、饮食及一般情况均未产生影响，也未影响到正常大鼠的膀胱组织学类型。结论：1.水飞蓟宾可通过剂量及时间依赖的方式抑制膀胱癌5637细胞的体外增殖并诱导其发生凋亡；2.外源性及内源性凋亡信号通路均参与了水飞蓟宾所诱导的膀胱癌细胞凋亡；3.水飞蓟宾通过激活Cyto C/Omi/caspase依赖及AIF/caspase非依赖途径诱导膀胱癌5637细胞发生凋亡；4.口服水飞蓟宾可显著抑制膀胱癌裸鼠皮下移植瘤的生长，且该抑制作用也与caspase依赖性及caspase非依赖性凋亡通路的激活有关；5.早期及晚期膀胱灌注水飞蓟宾均可抑制MNU所诱导的大鼠膀胱癌的发生及发展，且该抑制作用是通过诱导细胞凋亡来实现的。6.水飞蓟宾可能是一种具有发展前景且相对安全的预防及治疗膀胱肿瘤的新型膀胱灌注药物。