从真菌中提取的植物激活蛋白是一类热稳定蛋白,具有诱导植物抗性和促进植物生长的作用。本研究进行了交链孢菌(Alternaria.sp.)激活蛋白(简称ActP)的双向电泳鉴定、抗体制备,通过筛选cDNA表达文库,获得ActP蛋白基因,纯化了该基因的表达蛋白,为深入研究激活蛋白结构和作用机理奠定了基础。 首次进行了交链孢菌激活蛋白的双向分离。通过比较不同蛋白提取缓冲液,选用2mMEDTA溶液成功提取交链孢菌激活蛋白;对此蛋白进行等电聚焦和双向电泳,确定其pI为4。 特异性ActP35抗体的制备。电泳分离获得分子量为35kD交链孢菌激活蛋白(简称ActP35),以此为抗原免疫动物,制备兔多抗血清。本研究对斑点固相亲和纯化方法进行了改进,消除抗体和大肠杆菌之间的交叉反应,成功制备了大量高特异性ActP35抗体。 利用获得的抗体免疫筛选交链孢菌cDNA表达文库。用纯化的ActP35蛋白抗体,从交链孢菌菌cDNA表达文库中筛选获得9个阳性克隆,测序结果与激活蛋白ActP35质谱鉴定肽段序列比较,获得一个相似性较高的克隆。将此克隆所含基因(简称actd—2)进行表达,利用鳌合有镍离子的亲和层析柱成功分离、纯化表达蛋白。 首次利用抗体免疫杂交技术研究交链菌激活蛋白和植物蛋白的互作蛋白。用Far Western、抗体亲和纯化的方法研究发现,证明ActP35蛋白的抗体能够特异性识别拟南芥中1,5—二磷酸核酮糖羧化氧化酶,表明两蛋白可能有相同或相似的氨基酸序列。为激活蛋白作用机理研究提供证据。