类风湿关节炎（rheumatoid arthritis, RA）是以损害滑膜、软骨和骨为主的系统性自身免疫疾病。其病程体现了自身免疫反应、细胞因子炎症及滑膜增生等主要病理过程。单核细胞和巨噬细胞产生的肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α,TNF-α）在RA滑膜炎中发挥重要作用。TNF-α有两个受体，TNF受体1（TNFreceptor1, TNFR1）含有死亡结构区域，主要介导细胞的凋亡；而TNFR2没有死亡结构区域，主要通过肿瘤坏死因子受体相关因子2（TNF receptor-associatedfactor2, TRAF2）连接的信号通路调节细胞的存活、活化和增殖。在RA患者血清及关节滑膜中均可测到TNF-α浓度升高，国内外研究表明阻滞TNF-α的作用能显著改善患者的临床症状，提高生活质量。重组人肿瘤坏死因子受体和人IgG-Fc段融合蛋白（recombinant human TNFR:Fc, rhTNFR:Fc），能够特异性结合两分子TNF-α，阻断TNF-α与细胞表面受体结合，从而抑制TNF-α生理活性，用于治疗难治性RA，并且rhTNFR:Fc联合传统免疫抑制剂甲氨蝶呤（methotrexate, MTX）治疗时表现出显著的疗效，但具体分子机制不明。已知TNFR2多表达于CD4⁺辅助性T（helper T, Th）细胞，Th细胞从中枢淋巴器官发育成熟后迁移到外周免疫器官，并通过分泌不同的细胞因子在RA的发生发展过程中发挥重要作用。其中，T细胞亚群比例的失衡及炎性细胞因子产生的免疫损害，是导致RA慢性炎症的关键因素。因此，rhTNFR:Fc和MTX联合使用对T细胞分化和功能的影响有待深入探讨。本课题组前期研究发现TNF-α体外刺激胶原性关节炎（collagen-inducedarthritis, CIA）大鼠的滑膜细胞，引起前列腺素E₂（prostaglandin E₂, PGE₂）受体（E-prostanoid receptor, EP）4信号通路发生异常变化，抑制滑膜细胞EP4的表达，降低环磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate, cAMP）水平，促进滑膜细胞的增殖。EP4受体为典型的G蛋白偶联受体（G preotein coupled receptor,GPCR），与兴奋性G蛋白（stimulatory guanine nucleotide-binding protein, Gαs）偶联，升高cAMP水平。G蛋白偶联受体激酶（G-protein-coupled receptor kinases,GRKs）和β-arrestin2是GPCR的重要调节分子。然而TNF-α究竟如何调节EP4信号通路，促进滑膜细胞异常增殖的分子机制尚不明确。本研究旨在观察rhTNFR:Fc联合MTX对小鼠CIA的治疗作用及对T细胞增殖、分化和功能的影响；并且在以往工作的基础上，进一步阐明TNF-α调节EP4受体信号促进人成纤维样滑膜细胞（fibroblast-like synoviocyte, FLS）过度增殖的分子机制，为揭示TNF-α参与RA病程的分子病理机制提供理论依据。目的：观察rhTNFR:Fc联合MTX对小鼠CIA的治疗作用及对T细胞功能的影响；揭示TNF-α调节EP4信号通路，诱导人FLS异常增殖的分子机制，以深入阐明TNF-α参与RA病程的分子病理机制。方法： DBA/1小鼠于d0和d21，尾根部、背部多点皮内注射100μg鸡Ⅱ型胶原乳剂诱导小鼠CIA模型。造模成功的DBA/1小鼠，随机分为5组，即正常组、模型组、rhTNFR:Fc组（4.5mg/kg/次，皮下注射，三天一次，用药15天（5次））、MTX组（2mg/kg，灌胃，每三天一次，用药5次）、rhTNFR:Fc（4.5mg/kg/次，皮下注射，三天1次，用药15天（5次））和MTX（2mg/kg，灌胃，每三天一次，用药5次）联合用药组。d41处死小鼠，观察关节炎指数评分，关节和脾脏病理检查及病理学评分，胸腺指数和脾指数；3H-TdR掺入法观察各给药组对T淋巴细胞增殖功能的影响；ELISA法检测培养上清中TNF-α、淋巴细胞毒素-α（lymphotoxin, LT-α）、IL-1β、核因子κB受体活化因子配体（receptor activatorfor nuclear factor-κB ligand, RANKL）、IL-10、IL-17、IL-6和干扰素-γ（Interferon-γ，IFN-γ）水平；流式细胞术检测胸腺、脾脏T淋巴细胞各亚群比率的变化情况。组织块培养法培养人FLS；环氧化酶抑制剂吲哚美辛（Indometacin, INN）抑制TNF-α诱导的PGE2的产生；MTT法检测TNF-α介导的人FLS细胞的增殖情况；流式细胞术检测胞膜TNFR1和TNFR2受体表达；放免法检测细胞内cAMP浓度；Western blot法检测TNF-α介导的TNF-α信号通路和G蛋白偶联信号中TRAF2、Gαs总蛋白、活性Gαs、EP4、GRK2分布情况；siRNA瞬时沉默人FLS中TRAF2基因表达，Western blot和逆转录PCR（reverse transcription PCR,RT-PCR）法鉴定干扰效果；RT-PCR检测EP4的mRNA水平；免疫共沉淀法检测TRAF2与GRK2或β-arrestin2的结合情况；ELISA法检测细胞培养上清中PGE2的浓度。结果:1rhTNFR:Fc联合MTX对小鼠CIA的治疗作用1.1rhTNFR:Fc联合MTX对CIA小鼠关节炎指数的影响d26小鼠足爪出现较明显红肿，CIA组足爪红肿逐渐加重。d35-d40，MTX（2mg/kg）和rhTNFR:Fc（4.5mg/kg）⁺MTX（2mg/kg）联合用药组可显著降低CIA小鼠关节炎指数；d38开始，rhTNFR:Fc（4.5mg/kg）可显著降低CIA小鼠关节炎指数。其中，联合给药组降低关节炎指数作用较rhTNFR:Fc组显著，与MTX组比无显著性差异。1.2rhTNFR:Fc联合MTX对CIA小鼠足爪和脾脏病理变化的影响CIA小鼠关节腔可见滑膜组织增生，衬覆多层滑膜细胞，炎性细胞浸润，血管扩张充血，血管翳出现，甚至出现骨和软骨破坏。rhTNFR:Fc、MTX和联合用药组可不同程度的抑制小鼠关节滑膜细胞增生、炎细胞浸润、血管扩张充血、血管翳生成等病理变化，显著降低病理评分；其中，联合给药组对滑膜炎症的抑制作用较rhTNFR:Fc组更强，对滑膜增生的抑制作用较MTX组更强。CIA小鼠脾脏可见白髓增生，表现为蓝染的淋巴细胞聚集区变大，生发中心出现；红髓增生，淤血，范围增大。rhTNFR:Fc、MTX和联合给药组可不同程度改善脾脏病理变化，白髓增生减轻或接近正常，红髓充血减轻，减少生发中心。其中，联合给药组对各项脾脏病理变化的改善作用较rhTNFR:Fc组更显著，对淋巴滤泡增生的抑制作用较MTX组更明显。1.3rhTNFR:Fc联合MTX对CIA小鼠胸腺和脾脏指数的影响与正常组相比，CIA小鼠胸腺和脾脏明显肿大，指数增加。rhTNFR:Fc和联合给药组对脾脏和胸腺指数均有明显抑制作用，两组之间没有显著性差异；MTX组可以显著降低胸腺指数，但对脾脏指数没有显著影响。1.4rhTNFR:Fc联合MTX对CIA小鼠T淋巴细胞增殖反应的影响ConA诱导的CIA小鼠胸腺T淋巴细胞增殖反应明显增强，rhTNFR:Fc、MTX和联合给药组均可明显抑制T淋巴细胞增殖反应，各给药组间没有显著性差异。1.5rhTNFR:Fc联合MTX对CIA小鼠血清和巨噬细胞培养上清细胞因子的影响与正常组相比，CIA小鼠血清IL-1β、TNF-α、RANKL和IL-6水平明显升高，IFN-γ水平明显降低。MTX组和联合给药组可显著抑制血清中IL-1β、IL-6表达；rhTNFR:Fc组和联合给药组可显著抑制血清中TNF-α、RANKL表达；各给药组对血清降低的IFN-γ水平没有显著影响。其中，联合给药组对血清IL-6的降低程度优于rhTNFR:Fc或MTX单用，各给药组之间对其它细胞因子作用没有显著性差异。与正常组相比，CIA小鼠巨噬细胞培养上清IL-17、LT-α水平显著升高，IL-10浓度降低。rhTNFR:Fc、MTX和联合给药组可显著降低巨噬细胞培养上清IL-17、LT-α表达，MTX和联合给药组显著升高IL-10浓度；但各给药组之间没有显著性差异。1.6rhTNFR:Fc联合MTX对CIA小鼠胸腺、脾脏T细胞亚群的影响与正常组比较，CIA组胸腺和脾脏CD4⁺/CD8⁺T细胞比例、总Th细胞（CD3⁺/CD4⁺）和活化Th细胞（CD4⁺/CD25⁺）比例均显著升高，未致敏Th细胞（CD4⁺/CD62L⁺）和Treg细胞（CD4⁺/CD25⁺/Foxp3⁺）比例显著降低。rhTNFR:Fc组、MTX组和联合给药组均可明显降低胸腺和脾脏CD4⁺/CD8⁺T细胞比例，且联合给药组降低脾脏CD4⁺/CD8⁺T细胞比例程度明显优于单用药组。rhTNFR:Fc组和联合给药组可显著降低胸腺总Th细胞、活化Th细胞比例，升高未致敏Th细胞、Treg细胞比例，联合给药组升高Treg细胞比例程度明显优于MTX组。rhTNFR:Fc组、MTX组和联合给药组可显著降低脾脏总Th细胞、活化Th细胞比例，升高未致敏Th细胞比例；rhTNFR:Fc组和联合给药组显著升高Treg细胞比例，且联合给药组升高Treg细胞比例的作用强于MTX组。2TNF-α调节人滑膜细胞前列腺素受体EP4信号的机制2.1TNF-α体外对人FLS增殖功能的影响TNF-α刺激人FLS增殖的亚适浓度为20ng/ml，作用最强在48h。TNF-α（20ng/ml）或TNF-α⁺INN（20ng/ml⁺1×10-6mol/L）刺激正常人FLS发现均可使细胞内cAMP水平显著降低，细胞增殖功能亢进。2.2TNF-α体外刺激人FLS后TNF-α信号通路的变化TNF-α刺激正常人FLS后，TNFR2表达水平明显升高，但TNFR1表达无显著变化；TRAF2总蛋白的表达水平显著增加，且TNF-α⁺INN比TNF-α增加更明显。2.3TNF-α体外对人FLS内G蛋白偶联信号中Gαs总蛋白、活性Gαs蛋白、总EP4及胞膜和胞浆EP4蛋白表达的影响由于EP4是通过偶联Gαs激活AC从而调节cAMP水平，因此我们检测TNF-α或TNF-α⁺INN处理后细胞中总Gαs蛋白、活性Gαs蛋白、总EP4蛋白及胞膜和胞浆EP4蛋白的表达。结果显示，TNF-α或TNF-α⁺INN显著增加了总EP4，胞浆EP4蛋白和EP4基因的表达；同时，显著降低了胞膜EP4蛋白的表达；进一步的结果发现，TNF-α组或TNF-α⁺INN组明显减少了活化Gαs蛋白的表达，而总Gαs蛋白表达无显著变化。2.4TNF-α通过TRAF2与GRK2偶联，调节胞膜GRK2蛋白的水平影响人FLS内G蛋白偶联信号为了探讨TNF-α如何通过其下游的分子降低cAMP水平，促进EP4受体的脱敏和内吞，我们进一步使用免疫共沉淀法检验TRAF2是否与GRK2或β-arrestin2蛋白偶联。结果发现TRAF2和GRK2或β-arrestin2均发生了相互作用，并且正常情况下人FLS中TRAF2-GRK2的相互作用较强，而当TNF-α或TNF-α⁺INN刺激后，相互作用的TRAF2和GRK2水平显著下降。进一步结果显示胞膜上的GRK2表达在一个较高的水平。TRAF2和β-arrestin2的偶联没有显著改变。2.5TNF-α体外对人FLS内PGE₂水平的影响由于TNF-α可以诱导人FLS中PGE₂的产生，我们检测了TNF-α或TNF-α⁺INN刺激后，细胞培养液中PGE₂的浓度。结果显示，由TNF-α处理后的细胞培养上清中PGE₂的浓度显著增加，而TNF-α⁺INN能显著减少PGE₂的浓度。2.6干扰TRAF2表达后对TNF-α促进人FLS增殖功能的影响用siRNA法干扰人FLS中TRAF2表达后，细胞内TNF-α或TNF-α⁺INN刺激后cAMP水平显著升高，增殖能力均明显减弱，且TNF-α⁺INN几乎失去了引起细胞增殖的能力。2.7干扰TRAF2表达后对TNF-α引起人FLS内总EP4蛋白及胞膜和胞浆EP4、GRK2蛋白表达改变的影响干扰TRAF2表达后，总EP4蛋白表达水平和胞膜EP4蛋白表达水平明显地增加，而胞浆EP4蛋白，基因表达水平显著降低；TRAF2-GRK2偶联明显逐渐减弱，胞膜上GRK2蛋白显著降低，胞浆GRK2蛋白明显增加。2.8干扰TRAF2表达后对TNF-α刺激人FLS产生PGE₂水平的影响干扰TRAF2表达后，TNF-α或TNF-α⁺INN对TNF-α诱导的PGE₂产生没有显著性影响。结论：1. CIA小鼠T淋巴细胞增殖异常；血清中IL-1β、RANKL、TNF-α、IL-6表达均增高，IFN-γ水平降低，巨噬细胞培养上清中IL-17、LT-α表达升高，IL-10表达降低；脾脏和关节发生病理改变；胸腺和脾脏CD4⁺/CD8⁺T细胞比例、总Th细胞和活化Th细胞比例均显著升高，未致敏Th细胞和Treg细胞比例显著降低。rhTNFR:Fc、MTX及rhTNFR:Fc⁺MTX联合给药组通过抑制CIA小鼠T淋巴细胞异常增殖，调节细胞因子水平和T淋巴细胞亚群比例的平衡，对CIA小鼠上述症状具有不同程度的治疗作用，并且联合给药在关节炎指数、滑膜炎症、滑膜增生、各项脾脏病理变化、淋巴滤泡增生、血清IL-6、胸腺和脾脏Treg细胞以及CD4⁺/CD8⁺比例程度等方面较单用MTX或rhTNFR:Fc对小鼠CIA的治疗作用更明显。2. TNF-α可以显著促进人FLS的增殖，其机制不仅与TNF-α的受体偶联信号有关，且与其调节PGE₂-EP4-Gαs-cAMP信号转导有关。正常FLS中，TRAF2和GRK2相互结合，TNF-α刺激可上调TRAF2总表达，使其与GRK2分离，促进GRK2转膜，引起EP4受体脱敏和内吞，降低cAMP水平。