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肿瘤过继性细胞免疫治疗(Adoptive cell immunotherapy,ACT)近年来取得了显著进展。获得以分泌IFN-γ等为特征的肿瘤抗原特异性CD8+细胞毒T淋巴细胞(CD8+cytotoxic lymphocyte,CD8+CTL,即Tcl细胞),并使之在体内发挥杀伤肿瘤活性,是目前肿瘤过继性T细胞免疫治疗常用的技术方法。然而,由于Tcl细胞强大的杀伤效应所引发的细胞因子释放综合症,及Tcl终末分化导致其在体内发挥功能的持久性有限等因素,限制了以Tcl分化类型为主要导向的过继性细胞免疫疗法在临床上进一步有效和广泛应用。因此,设计回输后具有长期存活或增殖能力、对肿瘤具有持续杀伤功能等特性的过继性CD8+T细胞,对提高肿瘤免疫治疗的效果具有十分重要的意义。近期的研究揭示,以表达IL-9、IL-10、IL-21和IL-22等细胞因子为特征的Tc9细胞对肿瘤的抑制效果显著强于Tcl细胞,其在体内具有持久的抗肿瘤效应、不易发生功能耗竭、存活时间较长等特性。因此,Tc9细胞可作为一种比较理想的CD8+T细胞分化类型,应用于肿瘤过继性免疫治疗。寻找能有效促进Tc9细胞分化的方法,对肿瘤免疫治疗具有重要的创新意义和潜在的应用价值。本研究旨在探讨IL-36β对Tc9细胞分化的促进作用,并初步分析IL-36β促进分化的Tc9细胞在肿瘤过继免疫治疗中的效应,以期为寻找促进Tc9分化的有效手段与方法奠定理论基础。第一部分IL-36β对Tc9细胞分化促进作用的研究[目的]研究IL-36β对Tc9细胞分化的促进作用,并初步探讨其促进分化的Tc9细胞的生物学特性。[方法]采用免疫磁珠纯化C57BL/6j小鼠CD8+T细胞,在Tc9及Tc0,Tcl,Tc2,Tc17等细胞亚群分化条件下,以及在TGF-β、IL-4等细胞因子组合条件下,加或不加入IL-36β,用anti-CD3和anti-CD28抗体包板进行刺激,通过实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR,QRT-PCR)和流式细胞术,分析各组细胞中IL-9基因和蛋白质的表达水平;并在TGF-β、IL-4等细胞因子组合条件下,加或不加入IL-36β,采用抗原提呈细胞(Antigen βresenting cell,APC)负载OVA抗原肽(SIINFEKL),刺激经免疫磁珠纯化的OT-I小鼠来源的CD8+T细胞,经流式细胞术分析其IL-9蛋白质表达水平,采用ELISA检测其细胞培养上清中IL-9和IL-10分泌水平;此外,通过转录组测序,分析经TGF-β与IL-4刺激的经典Tc9细胞和联合IL-36β促进分化的Tc9细胞中相关细胞因子、转录因子等基因的表达情况。[结果]结果表明,IL-36β不同程度地上调了 Tc0,Tc2,Tc17细胞亚群中IL-9基因的表达,在Tc9细胞分化条件下,IL-36β可显著性促进IL-9、IL-10基因和蛋白水平的表达;转录组测序结果表明,IL-36β上调Tc9细胞中IL-21、IL-22、BATF等与Tc9细胞相关的特征性细胞因子和转录因子的表达,并促进了 IFN-y、FasL、穿孔素、GzmA、GzmB、GzmC等效应性分子的表达,同时下调Foxp3的表达。[结论]IL-36β可显著促进Tc9细胞相关细胞因子和转录因子的表达,并上调部分效应性分子的表达,其对Tc9细胞的分化及功能具有促进作用。第二部分IL-36β促进分化的Tc9细胞在肿瘤过继免疫治疗中作用的初步研究[目的]探讨IL-36β促进分化的Tc9细胞在肿瘤过继免疫治疗中的效应,并初步分析其可能的作用机理。[方法]在CD45.1或CD45.2背景的C57BL/6j小鼠腹部外侧皮下接种B16-OVA细胞,构建荷瘤小鼠模型;于荷瘤第5天腹腔注射环磷酰胺短暂删除小鼠体内的淋巴细胞,第6天腹腔注射负载OVA抗原肽(SIINFEKL)的骨髓来源的树突状细胞(Bone marrow-derived dendritic cell,BMDC),并同时采用体外刺激培养的OVA抗原特异性CD45.2+Tc9等CD8+T细胞亚群进行过继治疗,每2天观察肿瘤生长和荷瘤小鼠生存情况,绘制肿瘤生长曲线与小鼠生存曲线;在细胞过继治疗20天,经流式细胞术检测荷瘤小鼠的肿瘤组织、脾脏及肿瘤引流淋巴结中外源性 CD8+T 细胞(CD45+CD8+CD45.2+)与内源性 CD8+T 细胞(CD45+CD8+CD45.2-)的比例,及检测分析外源性和内源性CD8+T细胞亚群IL-9、IFN-y的表达水平和免疫卡控点分子PD-1、CD244等表达情况。[结果]与TGF-β和IL-4这一经典条件下诱导形成的Tc9细胞相比,联合IL-36β促进分化的Tc9细胞能够更有效地抑制肿瘤生长,延长荷瘤小鼠生存期;IL-36β促进分化的Tc9细胞过继治疗组的肿瘤组织、脾脏及肿瘤引流淋巴结内均可检测到较高比例的外源性CD8+T细胞;在经典Tc9和IL-36β促进分化的Tc9过继治疗组之间,外源性和内源性CD8+T细胞中IL-9与IFN-γ表达水平无明显差异;在过继治疗的两组荷瘤小鼠之间,内源性CD8+T细胞的PD-1与CD244表达未见明显差异,而与经典Tc9过继治疗组相比,经IL-36β诱导的Tc9过继治疗组中,外源性CD8+T细胞的PD-1与CD244表达具有相对较低水平的表达。[结论]与经典条件下分化形成的Tc9细胞相比,IL-36β促进分化的Tc9细胞具有更显著的肿瘤过继治疗效果,其过继转移后在荷瘤小鼠体内具有更高水平的分布,并表达较低水平的免疫卡控点分子PD-1和CD244。