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胆管癌是一类严重威胁人类健康的消化道恶性肿瘤,且发病率逐年攀升。与许多其它恶性肿瘤一样,胆管癌也是一种与癌基因激活和抑癌基因失活、细胞凋亡诱发基因和抑制基因调控失衡有关的、以细胞失控增殖为主要特征的基因病。而癌基因和抑癌基因的变异引起细胞内信号通路失调则是胆管细胞癌变的主要机制之一,因此对胆管癌的发生和恶性进展过程中涉及到的信号转导系统的研究显得非常重要。研究结果显示多条信号传导通路(如VEGF信号系统,酪氨酸激酶受体相关信号系统)均可诱导胆管细胞癌变过程发生,其中Ras/Raf/MEK/ERK信号通路十分重要。胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated ki-nase,ERK)是丝裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kirtles,MAPK)家族成员之一,ERK家族有5个亚族,包括ERK1-ERK5。其中ERK1和ERK2途径是ERK家族中研究最广泛彻底的,属于丝氨酸/苏氨酸残基的蛋白激酶,是细胞信号传导的重要途径。能将多种细胞外信号(如生长因子、细胞因子、肿瘤启动因子等)通过磷酸化活化逐级传递至细胞核,并激活多种核转录因子,参与细胞生长、发育、分裂及分化等。ERK1/2磷酸化后即P-ERK1/2,进入细胞核作用于Elk-1、c-myc、c-fos、c-jun、NF-κB等转录因子可磷酸化核转录因子和其他蛋白激酶等多种底物,调节相关基因的转录,进而参与细胞生长、发育、分裂及细胞间的功能同步等多种生理过程,并在细胞恶性转化等病理过程中起重要作用。
因此研究ERK1/2、P-ERK1/2两者在胆管癌中的表达,以及与胆管癌生物学行为的关系,具有重要的临床意义和社会价值。这也是我们开展此研究的目的所在。
材料和方法：
一、一般资料：标本来源选择中国医科大学附属盛京医院病理科存档石蜡包埋标本(2005年1月-2009年10月)手术切除原发性肝外胆管癌标本74例。所有标本术前均未进行放化疗,并经病理确诊胆管癌组织,对照为25例胆囊结石胆囊管组织。病例标本中男性例数为:45例,女性标本为:29人,年龄23～73岁,平均61岁。按胆管癌病理分级:高分化23例,中分化37例,低分化14例。淋巴结转移44例,无淋巴结转移者为30例。按UICC分期标准进行分期,Ⅰ期24例,Ⅱ期25例,Ⅲ～Ⅳ期25例。对照组病例中男性例数为:15例,女性标本为:10人,年龄18～68岁。
二、实验方法及试剂：
(一)主要试剂：鼠抗人ERK1/2和P-ERK1/2单克隆抗体购自NeoMarker公司；兔抗人HER-2多克隆抗体购自武汉博士德公司；SP试剂盒、DAB显色剂均购自北京中杉金桥公司。
(二)实验方法：用S-P法免疫组化染色,ERK1/2和P-ERK1/2一抗稀释度均为1:100,二抗稀释度均为1:200。阴性对照采用PBS液代替一抗,阳性对照采用北京中杉金桥公司提供的阳性片。
(三)观察：由两位有经验对病情不了解的病理科医生观察染色结果,ERK1/2的阳性着色为细胞质内出现黄色或棕黄色颗粒；P-ERK1/2阳性表达为细胞核或细胞质出现黄色或棕黄色颗粒。在高倍镜下(×400)随机选择5个视野,各计数200个细胞,共计1000个,观察着色强度并计算每张切片阳性细胞百分率。ERK1/2阳性分级标准:先按着色强度:无色0分,浅黄色1分,棕黄色2分,棕褐色3分；再按阳性细胞所占百分比,无阳性细胞数为0分,阳性细胞数＜10％为1分,10％～50％为2分,＞50％为3分,参考Cooper等的报道:着色强度与阳性细胞百分比的乘积:0～3分为阴性(-),4～6分为弱阳性(+),7～9分为强阳性(++)。P-ERK1/2阳性分级标准:先按着色强度:无色0分,浅黄色1分,棕黄色2分,棕褐色3分;再按阳性细胞所占百分比,参考Zhong等的报道:无阳性细胞数为0分,阳性细胞数＜1％为1分,1％～10％为2分,10％～50％为3分,＞50％为4分；着色强度与阳性细胞百分比的乘积:0～3分为阴性(一),4～6分为弱阳性(+),7～9分为中度阳性(++),10～12分为强阳性(+++)。
(四)随访结果：定义从手术后到病人死亡的时间为生存时间,时间的测度单位(月)。设定2010年9月1日为截止随访日,对于中途失访患者,其终止时间以最后一次访问时间为准。采用电话随访跟踪,失访16例,因胆管癌死亡50例,失访者为失去联系患者。
(五)统计学处理：采用SPSS13.0统计软件包处理数据。ERK1/2和P-ERK-1/2表达水平与临床指标相关性采用Pearson卡方检验,应用Kaplan-Meier法绘制生存曲线,单因素分析采用Kaplan-Meier模型,多因素分析采用COX比例风险模型,P＜0.05为有统计学意义。
结果：
一、ERK1/2和P-ERK1/2在胆管癌组织中表达情况：74例肝外胆管癌组织中ERK1/2和P-ERK1/2蛋白阳性表达率分别为32.4％(24/74)和60.8％(45/74)(图1-7)；在25例正常肝外胆管组织中,ERK1/2和P-ERK1/2蛋白表达阳性表达率分别为16％(4/25)和24％(6/25)(图8)；与正常肝外胆管组织比较,胆管癌组织ERK1/2和P-ERK1/2蛋白表达阳性表达率均显著高于正常肝外胆管组织(P＜0.05)。
二、ERK1/2和P-ERK1/2表达与胆管癌临床病理参数相关性：ERK1/2蛋白表达与肝外胆管癌患者年龄、性别、肿瘤大小、临床分期、淋巴结转移、分化程度比较后,均未见相关性。P-ERK1/2蛋白表达与肝外胆管癌患者淋巴结转移和分化程度密切相关:淋巴结转移患者肝外胆管癌组织中P-ERK1/2蛋白表达阳性率明显高于未发生淋巴结转移胆管癌患者(76.7％vs.50％,x2=5.323,P=0.021)；P-ERK1/2蛋白表达阳性在分化程度低的胆管癌组织中表达明显高于分化程度高的患者(x2=8.435,P=0.015)。P-ERK1/2蛋白表达与肿瘤大小、患者年龄、性别比较均未见相关性(表1)。
三、ERK1/2和p-ERK1/2表达与胆管癌患者预后的相关性：为了观察ERK1/2和P-ERK1/2表达与肝外胆管癌患者预后的相关性,我们对ERK1/2和P-ERK1/2表达与肝外胆管癌患者的总体生存期进行了统计分析,生存分析结果显示,ERK1/2表达水平与肝外胆管癌患者的总体生存期无统计学意义(P＞0.05,图9):P-ERK1/2表达阳性患者总体生存期明显短于P-ERK1/2表达阴性的肝外胆管癌患者(P=0.034,图10)
结论：胆管癌组织存在ERK1/2和P-ERK1/2高表达；P-ERK1/2表达与临床分期可作为胆管癌的预后因子。