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鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma, NPC)是中国南方数省高发的鼻咽部恶性上皮源性肿瘤。目前的研究表明，NPC发病是一个多因素、多阶段的过程。表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor, EGFR)在肿瘤的发生发展的各个阶段均扮演着重要的角色，人体多种肿瘤中EGFR均处于高表达状态。在NPC患者中EGFR表达阳性率明显高于对照组，并且肿瘤分化越差，EGFR表达阳性率越高；NPC有颈淋巴结转移者EGFR表达明显高于无颈淋巴结转移者。说明EGFR与NPC的发生、癌细胞分化和肿瘤进展有一定关系。 RNA干扰(RNA interference, RNAi)是指内源性或外源性双链RNA(double stranded RNA, dsRNA)介导的细胞内mRNA发生特异性降解，从而导致靶基因的表达沉默，产生相应的功能表型的缺失现象。这一现象属于转录后基因调控机制。目前RNAi已应用于基因敲除、基因表达调控、信号转导和基因治疗等方面的研究，与以往基因沉默的研究方法相比，RNAi能够更加高效特异地进行特定基因的抑制。利用这一崭新的技术使鼻咽癌细胞EGFR表达沉默，观察细胞水平变化，能够探讨EGFR与NPC之间的相关性，且具有高效、方便的优点。 本课题采用体外转录的方法合成EGFR特异性siRNA，将其瞬时转染人鼻咽癌细胞株CNE1和5—8F，检测转染后EGFR表达水平的变化，筛选有效干扰序列，并通过观察EGFR表达沉默后鼻咽癌细胞的生长情况，初步探索EGFR与鼻咽癌的相关性。 课题进行了如下工作： 1．在www.oligoengine.com上进行设计，得到三条siRNA序列。利用T7启动子体外转录合成单链RNA，退火后得到dsRNA，对dsRNA进行消化并纯化，获得高纯度的EGFR 5 iRNA。 2.分别以10nM、20nM、40nM和60nM的三对SIRNA用脂质体瞬时转染CNEI、5一SF，提取转染后24h、48h、96h和144h细胞总RNA和蛋白质，用半定量RT一PCR和Western Blot测定EGFR表达水平变化。RT一PCR结果显示，51 RNAI能够有效地沉默两种细胞的EGFR表达，抑制效率在24h时可达71.7%和67.5%，siRNAZ和SIRNA3则无法有效干扰EGFR表达。RT一PCR和Western Blot显示，在一定范围内随SIRNA浓度增加，对EGFR抑制效应增强，40nM时抑制效率最高。实验结果还表明，体外转录合成的siRNA作用时间有限，超过48h后效应减弱。 3.筛选出有效的SIRNA序列和最佳作用浓度后，将40nM SIRNAI转染两种鼻咽癌细胞，用台盼蓝染色计数法绘制细胞生长曲线，用流式细胞仪检测细胞生长周期变化。结果显示，EGFR表达沉默后，CNEI及5一8F生长速度明显下降。流式细胞仪检测发现，RNAi抑制EGFR表达能够诱导鼻咽癌细胞停滞在G1期。 本研究创新之处在于: 1.运用体外转录法合成SIRNA，成功建立了RNAi抑制鼻咽癌EGFR表达的新技术，为快速沉默特定基因表达提供了新方法。 2.首次在细胞水平证实，RNAi沉默EGFR表达可抑制鼻咽癌细胞生长，并诱导癌细胞停止在G1期。 3.对EGFR 5 iRNA在鼻咽癌细胞株CNEI和5一8F中的作用条件进行了优化，证实其最佳作用浓度为40nM，干扰效应在48h内最强 我们的工作为探索鼻咽癌发生发展机制和基因治疗提供了新思路。