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目的:阐明在肝损伤时,骨髓是如何影响肝纤维化形成的;探讨一贯煎抗肝纤维化效应与影响骨髓细胞归巢入肝分化的关系。
方法:经全身照射的ICR受鼠接受EGFP转基因ICR供鼠的骨髓后,经过4周骨髓系统的重建,模型组和一贯煎组小鼠接受13周的CCl4的皮下注射,一贯煎组在第8周时开始接受一贯煎灌胃治疗,并持续到第13周。7周末,13周末收集小鼠血清及肝组织。检测肝功能(ALT、AST、ALB、AKP、Tbil、γ-GT)及羟脯氨酸含量,明确小鼠肝损伤情况及胶原含量;HE染色及天狼星红胶原染色法,明确小鼠肝纤维化情况;免疫荧光组化法分析EGFP/α-SMA,EGFP/F4/80,EGFP/ALB共表达情况;Western印迹法分析肝组织MCP-1及CCR2的蛋白表达;RT-qPCR法观察肝组织MCP-1及CCR2 mRNA的表达。
结果:
1.肝功能及羟脯氨酸结果显示:与正常组相比,小鼠血清ALT、AST、AKP、Tbil、Hyp于造模后逐渐升高,13周时达到高峰(p<0.01),γ-GT也显著升高(p<0.05),ALB明显降低(p<0.01);与13周模型组比,一贯煎组ALT、AST显著降低(p<0.01),AKP、γ-GT、Tbil、Hyp也显著降低(p<0.05),ALB显著升高(p<0.05)。2.天狼星红染色结果显示:与正常组相比,7周模型、13周模型胶原面积积分值显著升高(p<0.05,p<0.01);一贯煎组与13周模型组相比,该值显著降低(p<0.05)。3.免疫荧光组化结果显示:与正常组相比,模型组EGFP阳性细胞明显增多,主要分布于小叶间隔,且EGFP/α-SMA双阳性、EGFP/F4/80双阳性表达显著增多(p<0.01,p<0.01),与ALB阳性细胞基本不重合。一贯煎组与模型组相比,EGFP阳性细胞在小叶间隔及肝实质部位均有分布,与α-SMA阳性细胞,F4/80阳性细胞重合减少(p<0.01,p<0.01),与ALB阳性细胞基本不重合。4.Western Blot结果显示:与正常组相比,7周模型组CCR2蛋白表达显著升高(p<0.01);13周模型组MCP-1与CCR2蛋白表达显著升高(p<0.01,p<0.01),与13周模型组比,一贯煎组MCP-1 CCR2表达显著下降(P<0.05,P<0.01)。5.RT-qPCR结果显示:与正常组相比,7周模型组MCP-1,CCR2 mRNA表达明显升高(p<0.05,p<0.05),13周模型组MCP-1,CCR2表达显著升高(p<0.05,p<0.05);与13周模型组比,一贯煎组MCP-1表达显著降低(p<0.05),CCR2表达下降,但无统计学意义。
结论:
1.在小鼠CCl4肝损伤模型中,骨髓细胞可归巢入肝,并向肝肌成纤维细胞分化,参与肝纤维化的进程,可向枯否细胞分化,不向肝实质细胞分化。
2.一贯煎可以改善骨髓移植CCl4肝纤维化小鼠肝功能,减轻肝纤维化时胶原沉积:可抑制骨髓细胞向肌成纤维细胞分化,从而改善肝纤维化程度。
3.骨髓细胞归巢入肝可能与MCP-1与CCR2之间的趋化作用相关。一贯煎可通过对MCP-1及CCR2基因及蛋白表达的干预,影响骨髓细胞向肝脏归巢,从而影响肝纤维化的进程。