红发夫酵母两阶段培养产类胡萝卜素研究

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虾青素(Astaxanthin)是一种红色的类胡萝卜素,为次级代谢产物,因其强抗氧化特性而被应用于各种领域。天然虾青素的生产主要来源于雨生红球藻(Haematococcus pluvialis)和红发夫酵母(Phaffia rhodozyma),虾青素是红发夫酵母所产的所有类胡萝卜素种类中含量最高的(≥70%)。在发酵生产方面,红发夫酵母因具有雨生红球藻所没有的一些优势而成为人们研究虾青素的重点对象之一,如无需光照、细胞浓度高和重金属含量低等。然而相比雨生红球藻,红发夫酵母虽然细胞浓度较高,但其虾青素含量和产量很低。此外,红发夫酵母的应用主要依赖于主产物虾青素的功效,导致其应用领域有所局限,亟需对除主产物虾青素之外的其它共产物进行应用开发。基于以上问题,本论文就红发夫酵母两阶段培养产虾青素及厌氧代谢产乙醇进行了研究。首先,本文结合文献报道研究了两种补料方式对红发夫酵母菌体生长及类胡萝卜素积累的影响,实验结果表明相较分批发酵,每隔12 h补加培养基使糖浓度维持在5~10g/L的流加补料方式能使细胞生物量、类胡萝卜素产量和生产效率分别提高36.38%、52.64%和39.02%,而半连续培养方式使细胞生物量、类胡萝卜素产量和生产效率分别提高74.30%、40.53%和27.98%。此外,本章节还初步探究了两种发酵促进剂对红发夫酵母生长及色素积累的影响,结果表明1 mg/L D-泛酸钙和5 mg/L木质素均能使细胞生物量提高,从而提高类胡萝卜素产量,产量提高幅度分别为28.89%和39.43%。基于补料和发酵促进剂实验存在的菌体快速生长和色素含量快速提高无法同时实现的现象,初步探究了红发夫酵母的两阶段培养可行性。先利用酵母最常用的YPD培养基对以上现象进行验证,再对红发夫酵母第二阶段的营养成分进行正交优化,尽可能延长稳定期让酵母继续积累色素,得到最优的组合为:4 g/L木糖,(NH4)2SO4为氮源,C/N比为40,0.5 g/L Mg SO4,1.0 g/L KH2PO4。在此基础上,研究了营养饥饿胁迫对第二阶段色素积累的影响,实验表明酵母在多种营养缺乏的条件下能合成与完整培养基相当的类胡萝卜素产量,因此第二阶段培养基可简化为4 g/L的木糖。此外,还探究了不同浓度Na Cl对酵母第二阶段类胡萝卜素积累的影响,结果表明1 g/L Na Cl能显著提高类胡萝卜素的含量和产量。最后,为研究红发夫酵母产乙醇的特性,以期在不影响类胡萝卜素产量的情况下探究红发夫酵母同步积累乙醇等相关产品的可行性,本文进一步探究了红发夫酵母的厌氧代谢。研究结果表明分批培养条件下,红发夫酵母在进行好氧发酵时主要进行菌体生长及色素合成,而在厌氧发酵时酵母的生长和色素积累均受到抑制,主要代谢合成乙醇,因此设置了好氧-厌氧两阶段的发酵实验,第一阶段好氧发酵积累菌体,第二阶段对不同温度下的厌氧发酵进行特性研究,结果表明在一定发酵时间内,除了28℃以外,酵母在4、22、和25℃下进行厌氧发酵时,其类胡萝卜素产量与初始值无显著差异,且22℃下乙醇产量最高,乙醇得率达0.49 g/g糖耗。液质联用分析结果表明,发酵体系中共检测到20种氨基酸(包括多肽)和47种有机酸,主要的风味物质是肉豆蔻酸乙酯、癸二酸二丁酯、4-甲基-5-噻唑乙醇、苯乙醛、4-羟基苯甲醛、吡嗪二酮类和有机酸类,其中癸二酸二丁酯、4-甲基-5-噻唑乙醇和4-羟基苯甲醛在其他产香酵母或者酿酒酵母所产的风味物质中是较少见的。
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