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目的1.通过应用羧基磁珠与外泌体表面蛋白相应的抗体偶联,运用免疫法进行血清外泌体的捕获,建立一种利用免疫磁珠捕获外泌体的方法。2.通过制备的免疫磁珠对外泌体进行捕获后,以磁珠做为固相载体,以外泌体类似为抗原,构建双抗体夹心体系,探索双抗体夹心法在制备的免疫磁珠上是否适用。方法1.免疫磁珠的制备:筛选免疫磁珠制备的工艺和制备中所需的最适抗体体积,运用酶联免疫吸附试验检测羧基一步法和羧基两步法两种工艺,以及抗体（浓度:1μg/μl）体积为10μl,15μl和20μl条件下制备的免疫磁珠的效率,检测OD值,实验数据重复三次,取其均数,数据以x描述,两组实验空白对照组均为未偶联任何抗体的空白磁珠。实验中所用抗体为单克隆鼠抗CD-63。2.免疫磁珠法捕获外泌体:收集河南省人民医院健康体检者血清20例,用制备的免疫磁珠根据抗原抗体特异性吸附原理捕获血清中的外泌体。设置对照组为经过同样操作步骤,偶联外泌体不相关抗体的磁珠,选用抗体为乙肝表面抗体。3.对捕获的结果进行鉴定:透射电子显微镜观察外泌体的形态和大小;Western blot分析外泌体的标志蛋白,Western blot所分析的蛋白为跨膜蛋白CD-63与肿瘤易感基因蛋白TSG-101。4.免疫磁珠与样本最适反应比例的筛选:根据10组血清样本外泌体捕获前后蛋白浓度变化差别的百分比（%）,评价捕获效率,筛选出免疫磁珠与血清样本最适反应比例,设置分组Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ,所对应的免疫磁珠和血清样本反应比例分别为1:1、1:2、2:1;电镜下观察是否捕获到外泌体,确定浓度改变原因;实验数据以均数描述,实验设计符合方差分析,通过SPSS13.0进行统计学分析处理,以P<0.05为有统计学意义。5.封保液效果评价:通过观察实验本底值,评价所制备的封保液的效果。免疫磁珠制备完成后,加入制备的封保液,4℃封闭过夜,空白对照为制备完成后加入PBS缓冲液保存的磁珠。依次加入稀释后的单克隆兔抗TSG-101以及HRP-羊抗兔,检测其OD值,试验数据以x进行描述。6.无外泌体样本筛选:通过检测超声破碎外泌体及超速离心剔除外泌体两种无外泌体处理方法处理后样本中外泌体的含量进行筛选,通过酶联免疫吸附试验对外泌体标志蛋白进行测定,测出OD值,实验设置正常样本质控组和空白组,数据以x±S进行描述,实验设计符合t检验,通过SPSS13.0对数据进行统计学分析处理,以P<0.05为有统计学意义。96孔板外泌体双抗体夹心实验已被验证可行,筛选通过96孔板进行,孔板包被外泌体标志蛋白对应的抗体（单克隆鼠抗CD-63）,进行外泌体捕获提取,使用Western blot分析外泌体标志蛋白验证是否可进行外泌体捕获。7.验证以磁珠构建的双抗体夹心体系是否适用:使用免疫磁珠对外泌体捕获后,以磁珠做为固相载体,加入外泌体表面另一种蛋白相对应的抗体（所用夹心抗体为单克隆兔抗TSG-101）,运用酶联免疫吸附试验对结合到外泌体表面的抗体进行检测,测出OD值。实验组为血清样本,对照组为经过无外泌体处理的血清样本,另设置空白组,空白组样本为磷酸盐缓冲液,用来观察实验本底值。空白组数据重复三次,取其均数,以x描述,实验组和对照组数据以x±S（均数加减标准差）描述,实验设计符合t检验,通过SPSS13.0对实验组数据和对照组数据进行统计学分析处理,以P<0.05为有统计学意义。结果1.羧基一步法（?）=174.932,羧基两步法（?）=106.032,空白组1（?）=2.892,抗体体积10μl （?）=91.325,15μl （?）=179.488,20μl （?）=179.702,空白组2（?）=3.383。2.透射电镜观察捕获的囊泡直径约在50-150nm之间,Western blot检测到外泌体标志蛋白CD-63和TSG101。3.电镜下观察到磁珠表面有囊泡聚集,粒径大小在50-150nm之间三组数据分别为:18.3%,37.8%,38.0%,三组数据之间比较P=0.502>0.05,Ⅰ组和Ⅱ组P=0.00<0.05,Ⅰ组和Ⅲ组P=0.00<0.05,Ⅱ组和Ⅲ组P=0.753>0.05。4.封保液组数据:（?）=4.588,PBS缓冲液组数据:（?）=32.630。5.Western blot检测到外泌体标志蛋白CD-63和TSG101;正常质控组数据:196.37±25.52,超速离心法剔除外泌体组数据:114.83±18.90,超声破碎组数据:117.01±21.40,空白组:（?）=9.28,两种无外泌体处理方法之间:P=0.44>0.05。6.空白组数据（?）=9.88,实验组数据190.00±18.81和对照组数据141.51±22.80,P=0.00<0.05。结论1.通过羧基磁珠偶联外泌体标志蛋白所对应的抗体制备的免疫磁珠,可以用来进行外泌体的捕获提取。2.以实验中制备的免疫磁珠为固相载体构建的双抗体夹心体系可以用来检测外泌体表面蛋白,双抗体夹心体系适用于本实验制备的免疫磁珠。