论文部分内容阅读
本研究的佐剂BCG-CpG-DNA是中国食品药品检定研究院自主研发,其主要成分是含有少量的蛋白和多糖的核酸(分子量在3000至15710bp之间的双链DNA),其中BCG-CpG-DNA浓度大约是多糖浓度的7倍,蛋白的150倍,并含有较多的非甲基化的CpG位点。由于CpG-DNA既有增强细胞免疫的刺激作用,又有增强体液免疫的刺激作用,在生物体内主要激发Th1型免疫模式应答,可作为新型人用疫苗免疫候选佐剂,但作为人用疫苗佐剂仍未应用于临床。然而,在疫苗的研发和临床实验中,对疫苗佐剂进行安全评价是必不可少的。特别在对一种新型的免疫佐剂缺乏理化性质、相关毒理学、相关免疫学研究和结论时,需要对疫苗佐剂开展一系列的临床前研究和评价,研究和评价应该涉及急毒实验、慢毒实验、单因子刺激和相关免疫学实验等。本实验旨在利用模式动物斑马鱼初步评价CpG-DNA的毒性,为佐剂的安全性提供一些基础的实验支持;为CpG-DNA的应用和推广以及疫苗的研发提供理论依据,进而为人类健康,抵御有害微生物侵袭起到一定的积极作用。免疫佐剂的安全问题是一个非常关键的问题,在重视的同时又很容易被忽视。因为佐剂本身具有的免疫学和药理学性质,可能会对疫苗免疫反应造成一定的困扰,甚至会激发一些安全性问题。有鉴于此,必须对免疫佐剂进行一系列的安全性研究和评估。
本研究以斑马鱼作为模式生物,斑马鱼胚胎为实验材料,利用疫苗佐剂CpG设置0.15,1.5,15 and75 mg/L4个剂量组暴露斑马鱼,并以TMT作为阳性对照,从胚胎期6 hpf后开始暴毒实验,研究其对斑马鱼发育、遗传、免疫以及行为毒性影响,每组做3个重复,实验重复三次。结果显示,CpG梯度剂量组与EM对照组无致死效应,孵化率、存活率以及死亡率CpG梯度剂量组与EM对照组无显著差异。TMT阳性对照组在胚胎中主要致畸效应为心胞肿大,TMT降低了斑马鱼胚胎的心率和孵化率,且对斑马鱼胚胎的自主运动、触摸运动都有影响,CpG梯度剂量组与EM对照组无显著差异,说明CpG无明显的发育毒性。行为学研究中,光刺激测试结果显示,胚胎自6hpf染毒至96hpf,96hpf后脱毒的斑马鱼仔鱼,第5天的光刺激刺激测试中,TMT组光暗交替时,鱼体放映速度明显上升,CpG梯度剂量组与EM对照组没有显著差异,结果说明TMT在斑马鱼胚胎中有发育和潜在的神经毒性,CpG无显著影响效应但是也无保护作用。TMT刺激斑马鱼的免疫系统,激发起免疫反应,其免疫荧光相对强度增强,CpG梯度剂量组与EM对照组无显著差异,结果说明单一的CpG佐剂不具备激发免疫反应的效应。
总之,TMT低剂量暴露对斑马鱼生长、发育、免疫及其神经等均有不同程度的影响,导致心胞肿大,对光暗刺激反应敏感。CpG组未观察到明显的畸形和死亡情况,其自主运动、触摸运动、行为检测、免疫强度检测与EM对照组均无明显差别。结果表明,BCG-CpG-DNA暴露对斑马鱼生长、发育、免疫及其神经均无明显的毒性作用,在斑马鱼的胚胎暴露中具有较好的安全性。鉴于人类与鱼类免疫机制差异性,不能单纯地从鱼类毒理实验直接推演至人类毒理机制。仍需进一步深入BCG-CpG-DNA的潜在致毒机制和免疫保护机制研究。