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防治脑缺血/再灌注损伤,寻找有效的治疗药物及措施,促进脑卒中后中枢神经系统功能恢复,一直是生命科学研究的重点和热点。研究发现,缺血前给予一定的预处理措施,能有效减轻缺血后的损伤,即缺血耐受(Ischemic tolerance,IT)。近年来,已发现众多不同的措施均能诱导产生缺血耐受效应。我们的研究已经证实电针预处理可以诱导大鼠产生脑缺血耐受。新近的研究发现电针预处理可以增加大鼠脑内源性大麻素2-AG和AEA的含量,并上调大麻素CB1受体,且CB1受体拮抗剂能够逆转电针预处理诱导脑缺血耐受。然而CB1受体是通过何种途径介导电针预处理诱导脑缺血耐受效应?越来越多的研究证明,CB1受体激活所介导的效应,如神经保护作用和抗焦虑作用均有ERK1/2通路的参与。已有大量研究证实,ERK1/2通路参与了许多预处理诱导的脑缺血耐受。那么CB1受体介导电针预处理诱导脑缺血耐受效应是否亦有ERK1/2通路的参与呢?本实验拟观察ERK1/2通路是否参与重复电针预处理诱导大鼠脑缺血耐受,以及重复电针预处理是否通过CB1受体调节ERK1/2磷酸化水平诱导脑缺血耐受。第一部分:ERK1/2通路激活参与电针预处理诱导大鼠脑缺血耐受实验一电针预处理对大鼠脑内ERK1/2磷酸化水平的影响目的:探讨电针预处理对大鼠脑内ERK1/2磷酸化水平的影响。方法:将20只雄性SD大鼠随机分为2组:假手术组(Sham组)和电针组(EA组)。Sham组:行戊巴比妥钠(40 mg/kg,i.p.)麻醉;EA组:腹腔注射戊巴比妥钠40mg/kg麻醉后取“百会”穴,选用疏密波、频率2/15 Hz、电流强度1 mA,持续电刺激30 min,以上处理每天1次,重复5天。分别在最后一次预处理后2h和24h ,取大鼠右侧大脑行Western blotting检测ERK1/2磷酸化(p-ERK1/2)水平。结果:最后一次预处理后2h,EA组p-ERK1/2蛋白表达水平与Sham组相比明显增高(P <0.05);而最后一次预处理后24h,EA组p-ERK1/2蛋白表达水平与Sham组相比无统计学差异。结论:重复电针预处理可以增高大鼠脑内早期p-ERK1/2的表达水平。实验二电针预处理对大鼠脑缺血再灌注后p-ERK1/2水平的影响目的:研究重复电针预处理对大鼠脑缺血再灌注后p-ERK1/2水平的影响。方法:将25只雄性SD大鼠随机分为3组:假手术组(Sham组)、对照组(CON组)和电针+缺血组(EA+MCAO组)。Sham组和CON组:行戊巴比妥钠(40 mg/kg,i.p.)麻醉;EA+MCAO组:腹腔注射戊巴比妥钠40mg/kg麻醉后取“百会”穴,选用疏密波、频率2/15 Hz、电流强度1 mA,持续电刺激30 min,以上处理每天1次,重复5天。CON组和EA+MCAO组大鼠在最后一次预处理后24h,行短暂大脑中动脉阻塞(MCAO)致局灶性脑缺血模型(缺血2h),再灌注2h和24h分别取右侧大脑行Western blotting检测ERK1/2磷酸化(p-ERK1/2)水平。Sham组大鼠栓线不插入大脑中动脉,其余操作同CON组。结果: CON组再灌注2h和24h p-ERK1/2蛋白表达水平较Sham组明显增高(p <0.05);EA+MCAO组再灌注2h和24h p-ERK1/2蛋白表达水平较CON组明显增高(p<0.05)。结论:缺血再灌注后脑内p-ERK1/2表达水平明显增高,重复电针预处理可以进一步增高缺血再灌注后大鼠脑内p-ERK1/2的表达水平。实验三MEK1/2抑制剂对电针预处理诱导大鼠脑缺血耐受的影响目的:探讨MEK1/2抑制剂U0126对重复电针预处理诱导大鼠脑缺血耐受的影响。方法:将48只雄性SD大鼠随机分为6组:假手术组(Sham组)、对照组(CON组)、电针+缺血组(EA+MCAO组)、U0126组、U0126+电针组(U0126+EA组)和DMSO+电针组(DMSO+EA组)。Sham组、CON组和EA+MCAO组的处理同实验二。U0126组腹腔注射MEK1/2抑制剂U0126 0.5mg/kg;U0126+EA组和DMSO+EA组电针预处理前30min分别腹腔注射U0126 0.5mg/kg或20% DMSO 0.6ml/kg。以上处理每天1次,重复5天。除sham组,其余大鼠均在最后一次预处理后24h,行短暂大脑中动脉阻塞(MCAO)致局灶性脑缺血模型(缺血2h),再灌注24h后,行神经功能学评分(NFS)和脑梗死容积百分比测量。结果:(1)神经功能学评分(NFS):EA+MCAO组NFS明显优于CON组(p<0.01);U0126+EA组与EA+MCAO组相比明显下降(p<0.01);而U0126组与CON组相比无统计学差异。(2)脑梗死容积百分比:EA+MCAO组脑梗死容积百分比明显小于CON组(p<0.01); U0126+EA组脑梗死容积百分比与EA+MCAO组相比明显增加(p<0.01);而U0126组脑梗死容积百分比与CON组相比无统计学差异。结论:MEK1/2抑制剂可以逆转重复电针预处理诱导大鼠脑缺血耐受,表明ERK1/2磷酸化参与重复电针预处理诱导大鼠脑缺血耐受。第二部分电针预处理通过大麻素CB1受体激活ERK1/2诱导大鼠脑缺血耐受实验一CB1受体拮抗剂AM251对电针预处理后p-ERK1/2的影响目的:探讨CB1受体拮抗剂AM251对重复电针预处理后p-ERK1/2的影响。方法:将40只雄性SD大鼠随机分为4组:假手术组(Sham组)、电针组(EA组)、AM251组和AM251+EA组。Sham组和EA组的处理同第一部分实验。AM251组:腹腔注射AM251 1mg/kg并麻醉;AM251+EA组:电针预处理前30min腹腔注射AM251 1mg/kg。分别在最后一次预处理后2h和24h取大鼠右侧大脑行Western blotting检测ERK1/2磷酸化(p-ERK1/2)水平。结果:在最后一次预处理后2h,EA组p-ERK1/2蛋白表达水平与Sham组相比明显增高(P<0.05);AM251+EA组与EA组相比,p-ERK1/2蛋白表达水平明显降低(P<0.05);而AM251组与Sham组相比无统计学差异。结论:CB1受体拮抗剂AM251可以逆转重复电针预处理引起的大鼠脑内p-ERK1/2表达增强,表明重复电针预处理通过CB1受体激活ERK1/2通路。实验二AM251对脑缺血再灌注后p-ERK1/2水平的影响目的:CB1受体拮抗剂AM251对脑缺血再灌注后p-ERK1/2水平的影响。方法:研究雄性SD大鼠45只,随机分为5组:假手术组(Sham组)、对照组(CON组)、电针+缺血组(EA+MCAO组)、AM251组和AM251+EA组。各组处理同第二部分实验一。各组大鼠在最后一次预处理后24h,行MCAO致局灶性脑缺血(2h)模型,再灌注2h和24h分别取大鼠右侧大脑行Western blotting检测ERK1/2磷酸化(p-ERK1/2)水平。结果:缺血再灌注后2h和24h,EA+MCAO组p-ERK1/2蛋白表达水平与CON组相比明显增高(P<0.05);AM251+EA组与EA+MCAO组相比p-ERK1/2蛋白表达水平明显降低(P<0.05);而AM251组p-ERK1/2蛋白表达水平与CON组相比无统计学差异。结论:CB1受体拮抗剂AM251可以逆转重复电针预处理引起的大鼠脑缺血再灌注后p-ERK1/2表达增强,说明重复电针预处理通过CB1受体激活ERK1/2通路诱导脑缺血耐受。小结1.重复电针预处理可增强早期大鼠脑内p-ERK1/2表达,而CB1受体拮抗剂AM251可以逆转重复电针预处理引起的大鼠脑内p-ERK1/2的表达水平增高,表明重复电针预处理通过CB1受体激活ERK1/2通路。2. MEK1/2抑制剂U0126可以逆转重复电针预处理诱导大鼠脑缺血耐受,表明ERK1/2磷酸化参与重复电针预处理诱导大鼠脑缺血耐受。3.缺血再灌注后脑内p-ERK1/2表达增强,重复电针预处理可以进一步上调p-ERK1/2的表达水平;而电针预处理的p-ERK1/2表达增强可被CB1受体拮抗剂AM251逆转,表明重复电针预处理通过CB1受体调节ERK1/2通路诱导大鼠脑缺血耐受。