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布鲁氏菌病(brucellosis)是由布鲁氏菌(brucella)引起的一种全球性流行的人畜共患病。布鲁氏菌感染宿主广泛,目前已知宿主包括60多种家畜、禽及野生动物。B.abortus感染牛后主要引起母畜的流产、死胎、弱仔。牛结核病(Bovine Tuberculosis)是由牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)和结核分支杆菌(Mycobacterium tuberculosis)引起的另一种人兽共患的慢性消耗性传染病,可引起乳房炎,结核性胸膜炎,产乳率和乳质下降等症状。奶牛最为易感。结核病病牛是本病的主要传染源。牛布鲁氏菌病和牛结核不仅造成巨大经济损失,而且可以成为人类的感染源,构成严重公共卫生危害。免疫接种是预防牛布鲁氏菌病的重要手段。B.abortus S19疫苗株长期应用于牛布鲁氏菌的免疫防制,其安全性和有效性得到充分证明。牛结核一直缺乏有效防制疫苗,其防控主要依赖被动的扑杀淘汰。近年来的研究进展表明,结核分支杆菌胞壁蛋白Ag85B抗原免疫动物可诱导有效保护性免疫反应。布鲁氏菌与结核分支杆菌均为间性胞内寄生的病原菌,二者致病与免疫反应机制相似;两种传染病经常共同持续感染牛群,特别是在发展中国家和边远落后地区。bp26基因是布鲁氏菌基因缺失标记疫苗的候选靶标。bp26基因的缺失突变不影响疫苗的免疫保护效率,但其诱导的免疫反应可以通过血清学方法与自然感染相区别。为此,本研究以bp26基因作为重组靶位点,将牛结核分支杆菌ag85b基因的开放阅读框和卡那抗性基因(筛选基因)同源重组到S19疫苗株的基因组中,取代bp26基因,筛选出双交叉插入外源目的基因的重组疫苗株S19-ag85b。Western blot结果显示Ag85B抗原蛋白在重组疫苗株获得正确表达。该重组疫苗株在连续含有卡那霉素的TSA-YE平板上传20代,仍保持ag85b基因稳定遗传和表达。重组疫苗株S19-ag85b与S19疫苗株分别以108CFU菌量腹腔途径菌株接种4-6周龄BALB/c小鼠,分别于接种后第1,3,6,9,12,15周扑杀小鼠,称量脾脏重量并检测脾脏荷菌情况。结果显示,随着时间推移,S19-ag85b和S19在小鼠脾脏内的数量持续减少,二者的荷菌量及消减趋势基本吻合,分别于15周左右基本清除。结果表明,S19-ag85b保持S19的低致病性生物安全特性。进一步对重组疫苗株与野生疫苗株进行免疫保护效力的比较试验。S19-ag85b和S19分别以105CFU剂量接种4-6周龄BALB/c小鼠。免疫后6周,分别以马耳他种M28强毒株104CFU菌量和牛种544强毒株5×104CFU菌量,通过腹腔接种途径对免疫小鼠进行攻击试验。分别于攻毒后15扑杀小鼠,称量脾脏重量并检测脾脏荷菌情况。结果显示,无论M28还是544攻击后,S19-ag85b和S19免疫鼠之间脾脏重量及荷菌量均无显著差异,但都显著低于PBS接种对照小鼠。结果表明,重组疫苗株S19-ag85b保持S19疫苗的免疫保护效力。本研究为牛布鲁氏菌病和结核的重组二联新型疫苗的探索研究奠定了初步的基础。