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复发和转移已成为乳腺癌患者死亡的重要原因，而近年来的研究表明乳腺癌干细胞(breast cancer stem cells，BCSC)不仅可以促使肿瘤的起始、恶化，并且是乳腺癌复发、转移的重要因素。在原发瘤中，一方面部分BCSC具有运动和远端转移的潜能，并且一部分BCSC还处在肿瘤侵袭的前沿，它们的自我更新能力及强致瘤能力促使它们通过循环系统在远处靶器官形成转移灶;另一方面肿瘤细胞经常通过发生上皮间质转化(epithelial-methylcamal transition，EMT)过程获得转移能力并侵袭基底膜及周围组织，从而进入循环系统，而非癌干细胞则可通过EMT过程获得类似BCSC的特征。这说明BCSC及EMT过程在乳腺癌的转移过程中发挥着重要作用并存在着复杂的分子调控网络，而研究表明包括miRNA在内的非编码RNA在BCSC及EMT的相互作用中起着重要的调节作用，已有许多miRNA可广泛用于诊断、预后及治疗的临床前研究。有些miRNA发挥着癌基因的作用，而另外一些miRNA则起着抑癌基因的作用，因此选择下调或过表达miRNA对肿瘤治疗的研究是一个很好的策略。在本研究中，作者通过miRNA芯片技术筛查发现，miR-7在BCSC中低表达，但文献对miR-7的功能报道并不一致，有研究认为它具有抑制乳腺癌转移的潜能，也有报道它可能有癌基因的功能，和Her2+乳腺癌及其他肿瘤的恶性有关，因此探讨miR-7在乳腺癌中的功能及分子机制，并进一步探讨它在调节BCSC中的作用，可能为靶向BCSC的乳腺癌治疗提供新的靶点和策略。 研究目的： 探索过表达miR-7对乳腺癌细胞及BCSC的调节作用及其分子机制，为靶向BCSC的肿瘤治疗提供新思路。 研究内容： 1.探讨MCF-7和MDA-MB-231细胞系中BCSC的表面标志并分选BCSC; 2.利用miRNA芯片技术比较CD44+CD24-BCSC和MCF-7细胞中miRNAs的表达差异; 3.利用生物信息学手段及双荧光报告系统确定miR-7的调节靶点; 4.慢病毒系统过表达miR-7对MDA-MB-231细胞EMT及侵袭迁移能力的影响 5.慢病毒系统过表达miR-7对BCSC在NOD/SCID鼠所致肿瘤的EMT及远端转移的影响; 6.miR-7调节乳腺癌转移能力的分子机制; 7.miR-7在BCSC中低表达的分子机制。 研究结果： 1.分别采用CD44+CD24-和CD326+CD44+CD24-为分子标志，利用免疫磁珠分选的方式从人乳腺癌MCF-7、MDA-MB-231细胞系中获得高纯度的BCSC。随后检测BCSC中的ALDH+细胞的活性，发现BCSC可以富集ALDH+细胞，综合判定MCF-7和MDA-MB-231细胞的BCSC分子标志分别为CD44+CD24-和CD326+CD44+CD24-; 2.miRNA芯片结果表明24个miRNAs的表达在CD44+CD24-BCSC和MCF-7细胞间存在差异，其中miR-7明显低表达;与MDA-MB-231细胞相比，miR-7在CD326+CD44+CD24-BCSC中也低表达; 3.生物信息学预测及双荧光报告系统结果显示，SETDB1是miR-7调节靶点; 4.在MDA-MB-231细胞中，慢病毒系统过表达miR-7可有效抑制SETDB1的表达、抑制细胞的侵袭转移能力、改变细胞的形态并在体内外抑制EMT过程;miR-7可以有效降低MDA-MB-231细胞中CD326+CD44+CD24-BCSC的含量; 5.MDA-MB-231细胞中的CD326+CD44+CD24-BCSC在NOD/SCID鼠具有较强的致瘤能力，并且BCSC所形成的肿瘤经miR-7治疗后，其EMT明显被抑制。此外，miR-7还能有效抑制了BCSC的肺、肾、肾上腺的远端转移; 6.在MDA-MB-231细胞中，用miR-7下调SETDB1后抑制了STAT3及其信号通路中下游关键因子twist、c-myc等的表达;Chip-PCR显示SETDB1可以结合在STAT3的启下游动子区域并可以促进STAT3的表达，随后Chip-PCR进一步证实STAT3可以结合于twist、c-myc的启动子区域并促进它们的表达;twist可以直接结合于E-钙连蛋白的启动子区域并抑制E-钙连蛋白的表达，c-myc通过miR-9直接抑制E-钙连蛋白的表达，因此过表达miR-7可以抑制SETDB1及STAT3信号通路的表达，从而增加E-钙连蛋白的表达量，抑制EMT; 7.MiR-7的表达可能被长链非编码RNA HOTAIR所抑制。在31例病人标本中HOTAIR和miR-7的表达成负相关，在MDA-MB-231细胞系中HOTAIR可以抑制抑癌基因HoxD10的表达从而促进乳腺癌的转移，而HoxD10可以直接结合于miR-7-1基因启动子的上游并促进它的表达，siRNA技术下调HOTAIR的表达可以促进HoxD10和miR-7的表达。 总结： 本研究首先通过比较MCF-7、MDA-MB-231细胞中BCSC的分子标志之间的联系与差异，确定了这两种细胞系的BCSC分子标志，并率先通过miRNA芯片技术发现miR-7在BCSC中低表达。利用慢病毒系统过表达miR-7可以有效的抑制MDA-MB-231细胞的EMT过程并抑制其侵袭转移;同时，miR-7还可有效抑制BCSC的远端转移。miR-7发挥抑癌功能的分子机制是通过下调癌基因SETDB1并进一步抑制STAT3信号通路来实现的。此外，BCSC中长链非编码RNA HOTAIR可能通过抑制HoxD10的表达而抑制miR-7的表达。总之miR-7是可以抑制乳腺癌的转移能力，为乳腺癌的治疗提供了一个新的治疗靶点。