论文部分内容阅读
研究背景类风湿关节炎（rheumatoid arthritis,RA）是一种全身性慢性自身免疫性疾病,主要病理表现为滑膜侵袭性增生和血管翳的形成,最终导致关节软骨及骨质破坏。血管翳由新生微血管、增生肥大的滑膜细胞、炎性细胞及机化的纤维素构成,具有类似肿瘤组织的特性,是引起关节病变、软骨破坏的主要病理基础。滑膜血管新生在血管翳的形成和维持中起到重要作用,而内皮细胞活化是血管新生的重要物质基础,其增殖、迁移、粘附及管形成能力在促血管形成的过程中处于中心地位。中医药治疗类风湿关节炎具有多成分、多靶点的作用优势,并且类风湿关节炎患者的骨质破坏与进行性滑膜炎和血管翳的形成密切相关,本课题组在前期研究中已经证明断藤益母汤（DTYM）能够显著改善类风湿关节炎患者的临床症状和实验室指标,在动物和细胞水平的证实DTYM能有效抑制滑膜的炎性增生,然而DTYM在抑制类风湿关节炎血管翳的形成方面还没有展开深入研究。因此我们推测:DTYM可能具有对RA血管翳内皮细胞活化调控的作用。本研究采用胶原诱导性关节炎（Collagen-Induced arthritis,CIA）小鼠模型及体外人脐静脉血管内皮细胞（Human umbilical vein endothelial cell,HUVEC）诱导模型,通过观察DTYM对CIA滑膜血管翳以及HUVEC细胞活化的影响,以阐明DTYM通过调控miR-337-3p介导VEGF通路抑制RA血管翳血管内皮细胞活化的机制。本研究将为DTYM临床诊疗应用提供科学依据,为RA创新药物研究奠定基础。一、断藤益母汤调控VEGF通路抑制CIA小鼠血管翳的形成目的:探讨断藤益母汤抑制CIA小鼠血管翳形成的作用及机制。方法:SPF级DBA/1雄性小鼠24只,7-8周龄,随机分为四组,分别是空白组（NC组）、模型组（CIA组）、甲氨蝶呤组（MTX组）、断藤益母汤组（DTYM组）,每组六只。除正常组外,其余组别小鼠均给予胶原与佐剂的乳化剂造模。自二次免疫起,给予灌胃等体积溶媒和药物,连续灌胃给药35天。观察小鼠的一般情况、关节炎指数。二次免疫35天后取膝、踝关节进行膝、踝关节micro CT扫描,以及进行膝、踝关节HE和番红-固绿染色并观察其病理改变,用免疫组织化学方法检测CD31、VEGF-α、VEGFR2、P-VEGFR2的表达。检测CIA小鼠血浆中miR-337-3p的表达。结果:在二次免疫后3天即有少数小鼠踝关节出现了红肿样改变,到二次免疫后7-14天时除正常组外,其他组别小鼠踝关节全部红肿,大部分小鼠出现活动受限的情况,在二次免疫后21天CIA组有部分小鼠踝关节出现了强直样改变。而与CIA组相比,DTYM组和MTX组踝关节红肿程度明显减轻。各组别关节炎指数评分结果显示:与CIA组比较,给药三周后的DTYM组和MTX组小鼠关节炎指数评分均显著下降（P<0.05或P<0.01）。HE染色结果显示:与CIA组比较,DTYM组和MTX组膝、踝关节关节面相对完整,滑膜增厚不明显,少量炎症细胞浸润。番红-固绿染色结果显示:与CIA组比较,DTYM组和MTX组小鼠膝、踝关节关节面相对完整,有部分软骨面较为粗糙,软骨厚度有明显增加。Micro CT结果显示:与CIA组比较,MTX组和DTYM组也均受到骨质破坏程度明显减轻;与CIA组比较,MTX组和DTYM组小鼠膝、踝关节骨破坏评分均明显降低（P<0.05或P<0.01）。CD31免疫组化显示:CIA组关节破坏严重,可见滑膜中明显的血管生成;而与CIA组比较,MTX组关节面正常,未见明显滑膜侵袭,仅在滑膜与骨质附着处有少量滑膜侵袭的痕迹;与CIA组比较,DTYM组关节面完整,有部分存在滑膜侵袭的迹象,但在侵袭处可明显未见棕色区域。光密度定量分析显示:与CIA组比较,DTYM组CD31光密度值显著降低（P<0.01）。VEGF-α、VEGFR2、P-VEGFR2免疫组化显示:CIA组在滑膜血管翳侵袭处可见明显VEGF-α、VEGFR2、P-VEGFR2的表达;与CIA组比较,MTX组关节面正常,未见明显滑膜侵袭,仅在滑膜与骨质附着处存在少量棕色区域;与CIA组比较,DTYM组关节面完整,有部分存在滑膜血管翳侵袭,在侵袭处可见少量棕色区域,有少量滑膜增生,滑膜与骨质附着处存在侵蚀,但未见明显棕色区域。VEGF-α、VEGFR2、P-VEGFR2光密度定量分析显示:与CIA组比较,DTYM组光密度值均显著降低（P<0.01）。CIA小鼠血浆miR-337-3p结果显示:与CIA组比较,DTYM组中小鼠血浆miR-337-3p水平则明显升高（P<0.01）。结论:DTYM可能通过调控CIA小鼠VEGF通路来起到抑制血管翳形成的作用,并且DTYM能够上调CIA小鼠中miR-337-3p的表达。二、断藤益母汤抑制体外HUVEC模型细胞活化的研究目的:验证断藤益母汤抑制体外HUVEC模型细胞活化的作用及机制。方法:采用CCK-8法检测DTYM对HUVEC细胞活力的影响,EDU细胞增殖检测试剂盒检测HUVEC细胞增殖能力,Transwell迁移法及鬼笔环肽荧光染色法检测细胞迁移功能,基质胶法检测对HUVEC细胞管形成能力。RT-q PCR检测HUVEC粘附因子E-selectin、ICAM1和VCAM1的m RNA表达。免疫印迹法检测DTYM对HUVEC细胞相关活化蛋白（VWF、CD31、ANG-1、CYR61）和VEGF信号通路蛋白表达的影响,细胞免疫荧光检测DTYM对HUVEC中CD31蛋白的表达。结果:CCK-8结果显示:和NC组比较,DTYM（200μg/ml）、DTYM（400μg/ml）、DTYM（600μg/ml）、DTYM（1000μg/ml）、DTYM（2000μg/ml）组HUVEC的细胞活力显著下降（P<0.01或P<0.05）;EDU细胞增殖结果显示:DTYM可显著降低HUVEC的增殖率（P<0.01）。Transwell小室迁移实验结果显示:与VEGF组比较,DTYM两剂量组能明显减少迁移到Transwell下室的细胞数量（P<0.01）,呈剂量依赖性;鬼笔环肽荧光染色实验结果显示:与TNF-α组比较,DTYM两剂量组能使HUVEC肌动蛋白表达明显减少（P<0.01）。管形成实验结果显示:与VEGF组比较,DTYM两剂量组能使HUVEC形成的管腔节点数目及管腔连接交叉点数明显减少（P<0.01）。RT-q PCR结果显示:与TNF-α组比较,DTYM两剂量组HUVEC中E-selectin、ICAM1和VCAM1 m RNA的表达均明显降低（P<0.01）,且呈剂量依赖性。Western blot结果显示:DTYM两剂量组能明显下调VWF、CD31、ANG-1、CYR61的蛋白表达水平。细胞免疫荧光显示:与NC组比较,TNF-α组CD31细胞免疫荧光强度明显升高（P<0.01）;而与TNF-α组比较,DTYM两剂量组CD31细胞免疫荧光强度均明显下降,（P<0.01）。Western blot结果显示:与TNF-α组比较,经过DTYM干预后HUVEC中VEGF-α、P-VEGFR2蛋白相对表达水平明显降低,VEGFR2蛋白相对表达水平则无明显改变。结论:DTYM能抑制HUVEC的增殖、迁移、粘附和管形成,从而抑制内皮细胞的活化,其作用机制可能与DTYM抑制HUVEC相关活化蛋白（CD31、VWF、CYR61、Ang-1）的表达以及调控VEGF信号通路有关。三、断藤益母汤上调miR-337-3p的表达调控体外HUVEC模型细胞活化的机制研究目的:验证断藤益母汤上调miR-337-3p的表达调控体外HUVEC模型细胞活化的机制。方法:采用荧光染色法检测在HUVEC细胞中miRNA转染效率。检测断藤益母汤和脂质体转染干预后HUVEC中miR-337-3p的相对表达。EDU细胞增殖检测试剂盒检测miR-337-3p对HUVEC细胞增殖的影响。Transwell体外迁移及鬼笔环肽荧光染色法标记细胞肌动蛋白表达检测细胞体外迁移功能。基质胶法检测miR-337-3p对HUVEC细胞管形成能力的影响。用免疫印迹法检测miR-337-3p对HUVEC细胞相关活化蛋白（VWF、CD31、ANG-1、CYR61）以及对VEGF信号通路蛋白的表达。免疫印迹法检测DTYM与miR-337-3p共干预对HUVEC细胞相关活化蛋白（VWF、CD31、ANG-1、CYR61）以及对VEGF信号通路蛋白的表达。结果:转染荧光实验结果显示:倒置显微镜下观察可见转染效率良好。与NC-mimic组（NCM组）比较,转染miR-337-3p mimic（337M组）的HUVEC中miR-337-3p的水平明显升高（P<0.01）;与NC-inhibitor组（NCI组）比较,转染miR-337-3p inhibitor（337I组）的HUVEC中miR-337-3p的水平明显降低（P<0.05）;与NC组比较,DTYM两剂量组HUVEC中miR-337-3p的水平均明显升高（P<0.01）,且呈现剂量依赖性。EDU细胞增殖结果显示:与NCM组比较,337M组HUVEC的增殖率显著下降（P<0.05）,而与NCI组比较,337I组HUVEC的增殖率显著上升（P<0.01）;Transwell结果显示:与NCM组比较,337M组迁出Transwell上室的细胞数量明显减少（P<0.01）;与NCI比较,337I组迁出Transwell上室的细胞数量增加不显著（P>0.05）。鬼笔环肽荧光染色结果显示:与NCM组比较,337M组HUVEC肌动蛋白表达明显减少（P<0.05）;与NCI比较,337I组HUVEC肌动蛋白表达增加不显著（P>0.05）。管形成实验结果显示:与NCM组比较,337M组HUVEC管腔节点数目及管腔连接交叉点数目明显减少（P<0.01）;与NCI组比较,337I组HUVEC管腔节点数目及管腔连接交叉点数目增多不明显（P>0.05）;免疫印迹结果显示,与NCM组比较,在TNF-α刺激下337M组HUVEC中VWF、CD31、ANG-1、CYR61以及VEGF-α、P-VEGFR2蛋白水平均明显降低。与NCI组比较,在TNF-α刺激下337I组HUVEC中CD31、CYR61蛋白表达水平有明显升高,而VWF、ANG-1则无明显改变。与NCI组比较,在TNF-α刺激下337I组HUVEC中VEGF-α蛋白表达水平明显升高,而P-VEGFR2则无明显改变。在TNF-α刺激下,与单独给与DTYM和337M组相比,DTYM与miR-337-3p mimic共干预的HUVEC中VWF、CD31、ANG-1、CYR61以及VEGF-α、P-VEGFR2蛋白表达水平明显降低。结论:DTYM可能是部分通过上调miR-337-3p的表达,来抑制VWF、CD31、CYR61、Ang-1的表达,以及抑制VEGF通路的激活来调控内皮细胞的活化,从而达到抑制CIA小鼠血管翳生成的作用。