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人源脂肪干细胞(h ADSCs)和人诱导多能干细胞(hi PSCs)来源的神经干细胞(NSCs)这两种干细胞都被认为是治疗脑卒中的理想种子细胞,然而目前尚未见h ADSCs和hi PSC来源的NSCs修复缺血性脑卒中效果及机制比较的相关报道。为利用干细胞和再生医学技术治疗中枢神经系统疾病(CNS)提供新的理论依据和技术支持,本课题旨在探讨哪种干细胞能更好地修复脑梗死及其调控相关机制。本课题分为体外试验和体内实验两部分。体外试验包括脂肪干细胞的分离、培养及鉴定,人i PSCs培养及向NSC诱导分化,应用免疫荧光染色技术对分化后的细胞进行NSC标志物Nestin、Sox2的表达鉴定;体内实验通过将慢病毒标记后的h ADSCs和hi PSC来源的NSC分别立体定向移植至用改良方法建立的小鼠大脑中动脉闭塞(Middle Cerebral Artery Occlusion,MCAO)脑卒中模型,观察这两种干细胞对小鼠缺血性脑损伤所致神经功能缺陷的修复作用,用5级评分法对其进行神经功能评分,并用水迷宫实验(Morris test)检测小鼠空间学习记忆能力的改变情况,免疫荧光染色追踪比较h ADSCs及hi PSC-NSCs在脑内的迁移方向、分化去向及功能整合情况,同时探讨这两种干细胞治疗脑损伤的相关机制。本论文包括以下两部分共三个章节:体外实验第一章脂肪干细胞的分离培养、扩增及表型鉴定目的:为获取稳定传代的脂肪干细胞来源,拟建立一种成熟且稳定的h ADSCs体外分离、培养方法,并了解其生物学特性。方法:利用贴壁培养法获得原代培养的h ADSCs,并传代扩增培养,选取第三至第五代的细胞采用细胞流式技术对脂肪干细胞表面标志物进行鉴定。结果:贴壁法原代培养h ADSCs两周后,用显微镜观察贴壁h ADSCs生长情况,细胞形态呈典型的梭形漩涡样。分离纯化的h ADSCs利用表面标志物CD44,CD45,CD19,CD73,CD105,CD11b,CD34和HLA-DR等进行免疫荧光鉴定,采用流式细胞技术对h ADSCs免疫表型进行鉴定,鉴定结果为h ADSCs表达间充质干细胞标记物CD44(100%),CD73(100%),CD90(100%),CD105(99.5%)和CD73CD105(99.5%),然而h ADSCs几乎不表达造血干细胞标志物如CD34,CD45,CD19,CD11b和HLA-DR(所有<3%)。本实验结果表明,分离、培养的h ADSCs具有间充质干细胞的特性,其相对纯度高于97%。在体外实验中,利用不同系统诱导分化培养基诱导h ADSCs向三系分化,体现了其多向分化潜能,如用油红O(Oil Red O)染色鉴定培养的h ADSCs诱导为脂肪细胞,茜素(Alizarin)染色鉴定培养的h ADSCs诱导为成骨细胞,甲苯胺蓝(Alcian blue)染色鉴定培养的h ADSCs诱导为软骨细胞。结论:本课题建立了成熟稳定的人源脂肪干细胞体外培养体系。分离、培养的h ADSCs不仅具有多向分化潜能还具有很强的体外扩增能力及间充质干细胞的特性。目前,在再生医学转化中,h ADSCs被认为是治疗脑卒中的理想种子细胞。第二章hi PSCs的培养及诱导分化为NSC目的:为了获得稳定传代的hi PSCs及hi PSCs来源的NSC,了解其生物学特性,用于移植修复缺血性脑损伤。方法:本实验组采用成熟稳定的培养及分化体系,培养hi PSCs细胞并诱导其定向分化为NSC,采用免疫荧光染色技术对分化后的细胞,对细胞标志物Nestin、Sox2的表达进行鉴定。同时,采用无血清无重组人碱性成纤维细胞生长因子(b FGF)的诱导培养基对hi PSCs来源的NSC诱导分化为神经元及星形胶质细胞,采用免疫荧光染色对细胞标志物TUJ1、GFAP的表达进一步鉴定。结果:获得成功诱导分化的NSC。加入无血清诱导培养基21天后,在显微镜下可观察到贴壁生长的细胞球形成典型的神经Rosette结构,采用免疫荧光染色,细胞球呈Nestin及Sox2阳性表达,贴壁培养21天后,细胞形成明显的神经网络状结构,免疫荧光鉴定显示细胞高表达Nestin、Sox2标志物。无血清无重组人碱性成纤维细胞生长因子(b FGF)的诱导培养基培养1周后,细胞球分化形成大量神经网络状结构。通过免疫荧光染色鉴定细胞标志物Nestin、SOX2、TUJ1及GFAP的表达,结果显示hi PSCs来源的NSC可以诱导分化为神经元及星形胶质细胞。结论:本课题组已成功建立了hiPSCs来源的NSC成熟稳定的培养及分化体系,获得的NSC具有较强的向神经系统分化的潜能,具有神经干细胞的性质,在目前的转化医学中,hi PSCs-NSC也被认为是治疗脑卒中的理想种子细胞。体内实验第三章脂肪干细胞与多能干细胞来源的神经干细胞治疗小鼠缺血性脑卒中的疗效评估目的:建立成熟稳定的缺血性脑卒中(MCAO)模型,评估比较两种不同干细胞对动物神经功能损伤的修复效果,为干细胞的临床应用和再生医学转化提供实验支持。方法:选用SPF级C57/BL6 4-6周雌性小鼠,体重在16-18g左右。通过5级动物神经功能行为评分及活体组织实验验证线栓法建立的小鼠MCAO模型是否成功。实验动物随机分为4组:h ADSCs组、i PSC-NSCs组、PBS组和Sham组。具体方法是,动物行为学评分评估建立模型后14天内所有动物每天的行为状况。建模成功7天后通过原位注射的方式缓慢微量多点地分别注射用表达增强型绿色荧光的慢病毒(FG12)感染标记的h ADSCs(106细胞/只)、hi PSC-NSCs(106细胞/只)到h ADSCs组、hi PSC-NSCs组,用相同的方式注射相同体积的PBS到对照组,Sham组不注射任何物质。接下来,用5级评分法(Zea Longa 5-grade scale)评估小鼠神经功能恢复情况。在细胞移植术后35天,采用水迷宫实验(Morris test)评估小鼠学习记忆能力恢复情况,TTC染色评估小鼠大脑的梗死面积。结果:96%的小鼠存活,建模成功的小鼠神经功能评分均在2-3分,采用TTC染色表明梗死部位及梗死灶区域大小一致。分别移植hi PSC-NSCs和h ADSCs至小鼠脑组织内后能够长期存活,免疫荧光染色显示移植35天后的移植区和脑损伤区均可见荧光标记的表达神经细胞标志物GFAP、Iba1的移植细胞,可见移植后的细胞能够迁移到缺血灶部位并分化为神经细胞;注射细胞组评分结果明显低于MCAO-PBS未注射细胞组,注射细胞组与MCAO-PBS未注射细胞组的评分结果有显著性差异,(P<0.05);而MCAO-hi PSCs-NSC-EGFP组神经功能缺损评分与MCAO-h ADSC-EGFP组相比评分结果无显著性差异,(P>0.05)。此外,水迷宫实验结果证明hi PSCs来源的NSC和h ADSCs可以改善小鼠学习记忆能力,注射细胞组空间学习记忆能力明显较细胞移植前好,同一时间节点较MCAO-PBS组好(P<0.05);而MCAO-hi PSC-NSC-EGFP组学习记忆功能恢复与MCAO-h ADSC-EGFP组比较无显著性差异(P>0.05)结论:MCAO模型是一种可重复率高、稳定性好的小鼠脑缺血模型;分别原位注射移植hi PSC来源的NSCs和h ADSCs至小鼠脑内,可定向迁移至脑缺血区并分化为神经细胞并长期存活。hi PSC-NSCs与h ADSCs均明显促进小鼠脑缺血损伤后的神经功能恢复,而两者治疗效果无明显差异。