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目的:宫颈癌是一种危害妇女健康的恶性肿瘤。持续高危型人乳头瘤病毒(human papilloma virus,HPV)感染是发生宫颈上皮内瘤样病变(CIN)和宫颈癌(CC)的最主要病因,尤其是HPV16、18型感染。HPV 16/18致病机制主要通过病毒致癌基因E6和E7分别与抑癌基因p53和视网膜母细胞瘤蛋白p Rb结合。E6抑制p53的活性,E7抑制p Rb的活性,使这些抑癌蛋白丧失功能,引起细胞的无限增殖和恶性转化,阻止细胞凋亡而致肿瘤发生。而癌的发生是一个多因素、多步骤、多阶段的复杂过程。研究表明,表观遗传学的改变和人类多种肿瘤的发生密切相关,抑癌基因DNA甲基化则是宫颈癌中最重要的表观遗传学修饰形式。表观遗传学改变与肿瘤遗传学改变不同,它具有可逆性,DNA去甲基化药物可以使表观遗传学机制介导的沉默基因恢复表达。因此研究去甲基化药物具有较深远的意义。上皮-间质细胞转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)是指具有极性的上皮细胞转化成具有运动能力的间质细胞的过程,并获得迁移和侵袭的能力。研究表明,EMT在宫颈癌进展中具有重要作用。Twist是碱性螺旋-环-螺旋(basic Helix-Loop-Helix,b HLH)转录因子家族成员,包括Twist1(即Twist)和Twist2。Twist1被认为是参与EMT过程中的关键调控因子,在肿瘤侵袭和转移中具有重要作用。此外,研究发现Twist1在宫颈癌中也存在DNA甲基化修饰,因此Twist1在EMT和DNA甲基化过程中均发挥作用。以往有较多研究发现去甲基化药物5-Aza-CdR对宫颈癌SiHa、He La细胞的增殖具有抑制作用,且具有浓度及时间依赖性,即随着浓度的升高(0.1-100umol/L)及时间的延长(24h、48h、72h、96h)对宫颈癌细胞增殖抑制作用逐渐加强。但其对HPV E6/E7的研究不一致。有些研究者发现5-Aza-CdR可降低HPV E6/E7的表达,而另一些研究者则认为5-Aza-CdR对其没影响。5-Aza-CdR对P53的研究较少,尚未发现对p Rb、Twist1的研究。本课题以HPV16阳性的SiHa细胞为研究对象,探讨DNA转移酶抑制剂5-氮杂-2’-脱氧胞苷(5-Aza-CdR)对宫颈癌SiHa细胞HPV16E6/E7、P53、p Rb、Twist1表达水平的变化。观察5-Aza-CdR能否通过去甲基化作用上调抑癌基因P53、p Rb的表达,降低癌基因Twist1的表达,为去甲基化药物应用于宫颈鳞癌的临床治疗提供实验依据。方法:1选取宫颈鳞癌SiHa细胞株进行培养。2采用四氮唑蓝(MTT)比色法检测其对SiHa细胞增殖的影响:实验组设5-Aza-CdR的浓度分别为10μmol/L、20μmol/L、40μmol/L,干预72h,对照组为未加药物组。每组设5个复孔。酶标仪检测吸光度,计算细胞活力。考察5-Aza-CdR对SiHa作用的量效关系。选取40μmol/L5-Aza-CdR处理组与对照组,进行后续研究。3采用实时荧光定量PCR(Real-time quantitative RT-PCR))方法检测实验组与对照组HPV16 E6/E7、p53、p Rb、Twist1基因mRNA表达水平,并比较两组间的差异。4应用Western-blot检测实验组与对照组p53、pRb、Twist1蛋白的表达水平,并比较两组间的差异。结果:1经终浓度分别为0μmol(对照组)、10μmol/L、20μmol/L、40μmol/L5-Aza-CdR处理SiHa细胞72h以后,MTT检测对照组与10μmol/L、20μmol/L、40μmol/L实验组的细胞活力(A490值)分别为:0.551±0.023、0.488±0.011、0.467±0.012、0.437±0.019,各实验组与对照组均存在差异,有统计学意义(F=56.010,P=0.000)。在一定浓度范围内随着5-Aza-CdR浓度的增加,SiHa细胞活力下降,抑制作用逐渐增强,呈量效关系。2经终浓度40μmol/L 5-Aza-CdR处理SiHa细胞72h以后,采用RT-PCR分别检测实验组与对照组HPV16 E6/E7、p53、p Rb、Twist1基因的mRNA含量。结果为:HPV16E6/E7 mRNA相对表达量较对照组降低,P<0.05;p53、p Rb mRNA表达量在实验组中较对照组升高,P<0.05;Twist1mRNA表达水平在实验组中较对照组下降,P<0.05。3经终浓度40μmol/L 5-Aza-CdR处理SiHa细胞72h以后,Western-blot检测结果显示:实验组抑癌基因p53蛋白的表达量(0.54±0.03)较对照组(0.50±0.04)明显升高,P<0.05;实验组p Rb蛋白表达量(0.51±0.04)较对照组(0.44±0.04)明显升高,P<0.05;实验组癌基因Twist1表达量(0.50±0.04)较对照组(0.62±0.03)表达明显降低,P<0.05。结论:1 5-Aza-CdR能抑制宫颈鳞癌SiHa细胞增殖,在一定浓度内抑制作用逐渐增强,呈量效关系;2 5-Aza-CdR能降低宫颈癌SiHa细胞株中HPV16 E6/E7的mRNA含量;3 5-Aza-CdR能上调抑癌基因P53、p Rb的mRNA含量和蛋白表达;4 5-Aza-CdR能降低癌基因Twist1的mRNA含量和蛋白表达,可能借此抑制宫颈鳞癌的EMT过程。