帕金森氏病(Parkinson’s disease,PD)是世界第二大神经退行性疾病,其主要病理特征表现为黑质多巴胺能神经元的变性死亡,路易氏小体的产生和神经免疫的过度活化和功能异常。近年来,神经炎症、初始免疫和获得性免疫与PD的发生和发展之间的关系研究日渐受到重视。同时,PD病人大脑黑质致密部(Substantia nigra pars compacta,SNpc)T、B淋巴细胞的浸润和外周血T淋巴细胞数量的变化也表明外周免疫系统在PD的发病进程中发挥着重要的作用。PD是多系统进行性的复杂性病变,其致病机理研究的还不是很透彻,目前普遍为大家所接受的是PD是由遗传因素、年龄因素和环境因素共同作用的结果。神经毒素1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(1-Methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine,MPTP)及其代谢产物1-甲基-4-苯基-2,3-二氢吡啶(1-methyl-4-phenyl-2,3-dihydropyridiumion,MPP+)是目前研究的最为广泛的可以引发PD的一个外源性神经毒素。内源性的MPTP类似物,1-甲基-4-苯基-1,2,3,4-四氢异喹啉(1-methyl-4-phenyl-1,2,3,4-tetrahydroisoquinoline salsolinol,Sal)及其代谢产物1,2-二甲基-6,7-二羟基-1,2,3,4-四氢异喹啉(1,2(N)-dimethyl-6,7-dihydroxy-1,2,3,4-tetrahydroisoquinoline,N-methyl-salsolinol,NMSal)现在被认为是可以引发PD的内源性神经毒素,但是其具体的作用机制研究的还不是很清楚。我们课题组在内源性神经毒素Sal和NMSal与PD的发生和发展方面进行了大量的研究,提出了“内源性神经毒素恶性循环”导致PD的病因性假说。实验室前期研究发现,内源性神经毒素Sal和NMSal可以引起多巴胺能神经元细胞SH-SY5Y氧化应激水平的升高、线粒体膜电位的变化、过表达alpha-synuclein(α-syn)蛋白的聚集以及细胞的凋亡。同时本实验室研究发现PD模型大鼠(6-羟多巴胺)的淋巴细胞中Sal N甲基转移酶水平与正常大鼠相比有所升高。这些研究都表明内源性神经毒素Sal和NMSal与PD的致病机理及神经免疫密切相关。本课题围绕神经毒素MPP+、Sal和NMSal特异损伤的多巴胺能神经元与淋巴细胞和单核细胞的作用展开研究。主要研究内容和研究结果如下:1.本课题采用SH-SY5Y(SH-SY5Y-EGFP)、U87和Jurkat三种细胞共培养模型,探索淋巴细胞在神经毒素特异损伤的多巴胺能神经元细胞中的作用。首先采用SH-SY5Y-EGFP、U87和Jurkat(淋巴细胞系)三种细胞混合培养的方式对jurkat细胞在内源性神经毒素特异损伤sh-sy5y-egfp细胞中的作用进行了研究。为了区分混合培养体系中的sh-sy5y和u87细胞,此部分实验采用的是稳转了绿色荧光蛋白egfp的sh-sy5y细胞,即sh-sy5y-egfp细胞。结果表明sal和nmsal不能诱导单独培养sh-sy5y-egfp细胞内源性α-syn蛋白的聚集,而u87细胞本身不表达α-syn蛋白;同时sal和nmsal也不能诱导sh-sy5y-egfp和u87两种细胞混合培养的体系中sh-sy5y-egfp细胞中的内源性α-syn蛋白的聚集;而sal和nmsal可以诱导sh-sy5y-egfp、u87和jurkat三种细胞混合培养体系中的sh-sy5y-egfp中的内源性α-syn蛋白的聚集,并且聚集的α-syn蛋白可以通过细胞间转运进入到u87细胞中;3种细胞混合培养体系中α-syn聚集的sh-sy5y-egfp细胞没有发生凋亡和坏死,但其lc3蛋白(自噬的标志蛋白)表达水平与对照细胞相比有所升高。提示jurkat细胞在sal和nmsal特异损伤的sh-sy5y-egfp细胞中发挥重要作用,可以协助sal和nmsal诱导sh-sy5y-egfp细胞中α-syn蛋白的聚集,同时α-syn蛋白的聚集可能与自噬的发生相关;在sal和nmsal处理的sh-sy5y-egfp、u87和jurkat三种细胞混合培养的同时在其中加入自噬引发剂rapamycin,可以诱导混合培养体系中sh-sy5y-egfp细胞lc3表达水平的上调和α-syn蛋白聚集的减少,进一步提示jurkat细胞在sal和nmsal诱导的sh-sy5y-egfp、u87和jurkat三种细胞混合培养体系中的sh-sy5y-egfp细胞α-syn聚集过程中发挥重要的作用,同时证实聚集的α-syn蛋白有可能是通过自噬的过程降解的,但其具体的分子机制还需要进一步的实验予以探讨。本课题采用sh-sy5y-egfp、u87和hpbl(人源原代外周血淋巴细胞)三种细胞混合培养的方式对hpbl细胞在sal和nmsal特异损伤sh-sy5y-egfp细胞中的作用进行了研究。sal和nmsal可以诱导sh-sy5y-egfp、u87和hpbl三种细胞共培养体系中的sh-sy5y-egfp中的内源性α-syn蛋白的聚集;同时在共培养体系中的α-syn聚集的sh-sy5y-egfp细胞中没有发生细胞的凋亡,但是α-syn蛋白聚集的sh-sy5y-egfp细胞的lc3蛋白表达水平与对照细胞相比有所升高,在人源原代的外周血淋巴细胞中再一次证实淋巴细胞与sal和nmsal特异损伤的sh-sy5y-egfp细胞中的内源性α-syn聚集过程密切相关,并且自噬可能与聚集的α-syn蛋白的讲解相关。2.本课题采用内源性神经毒素sal和nmsal损伤的sh-sy5y和u87细胞共培养的条件性培养基对淋巴细胞和单核细胞的影响进行研究。首先对条件性培养基中细胞因子的变化进行研究。我们对条件性培养基中的与pd的神经免疫密切相关的12中细胞因子il-6、il-1β、tnf-α、ccl2、cxcl12、ccl20、cxcl4、il-2、ssao、α-syn、il-1、il-4的表达水平进行了检测。结果显示:经内源性神经毒素sal损伤的sh-sy5y与u87细胞共培养的条件性培养基可以诱导jurkat/thp1细胞的增殖;而经内源性神经毒素nmsal损伤的sh-sy5y与u87细胞共培养的条件性培养基可以诱导jurkat细胞的增殖,同时可以降低nmsal对thp1细胞的毒性作用,减少细胞凋亡水平。以上实验结果提示条件性培养基中存在一些变化的可溶性的小分子可以介导jurkat细胞的增殖,研究发现sal处理的条件性培养基中的il-6和ccl2水平与正常的培养基相比有所升高;而nmsal处理的条件性培养基中的il-6和cxcl12水平与正常的培养基相比有所升高,表明条件性培养基中的细胞因子在保护及诱导jurkat/thp1细胞的增殖的过程中发挥重要的作用,同时也说明sal和nmsal的作用机制有所不同;研究还发现外源性给予jurkat细胞il-6不能引起其细胞数量的变化,说明il-6细胞因子需要在其它细胞因子的协同作用下共同调控jurkat/thp1细胞的增殖速率。3.本课题采用外源性神经毒素mpp+,以及内源性神经毒素sal和nmsal损伤的sh-sy5y和u87细胞共培养的条件性培养基对jurkat(淋巴细胞系)细胞效应机制进行研究。结果显示:经外源性神经毒素mpp+损伤的sh-sy5y和u87的共培养体系的条件性培养基可以降低jurkat的生长速度,其中高浓度500μmmpp+损伤的sh-sy5y和u87细胞共培养的条件性培养基引起jurkat细胞的肿胀、直径增大、细胞膜的损伤进而导致细胞坏死;而低浓度100μmmpp+损伤的sh-sy5y和u87细胞共培养的条件性培养基可以引起cdc2蛋白水平升高,g2/m期的细胞周期阻滞,进而导致的jurkat细胞生长速度的减慢。经内源性神经毒素sal和nmsal损伤的sh-sy5y与u87细胞共培养的条件性培养基可以诱导jurkat细胞的增殖。同时研究发现sal损伤的条件性培养基可以诱导jurkat细胞上il-6和ccl2的细胞因子受体il-6r和ccr2mrna水平的表达上调,nmsal处理的条件性培养基可以诱导jurkat细胞上il-6和cxcl12的细胞因子受体il-6r和cxcr4的mrna水平的表达上调;sal和nmsal损伤的条件性培养基均可以活化jurkat细胞中的mtor信号通路,引起s6k1、4e-bp1、pi3k、akt、mtor蛋白磷酸化水平的升高和mtor的mrna表达水平的上调;在sal和nmsal损伤的sh-sy5y和u87细胞共培养的条件性培养基培养jurkat细胞的同时,加入mtor的抑制剂rapamycin,可以抑制条件性培养基诱导的jurkat细胞的增殖,s6k1、4e-bp1、pi3k、akt、mtor蛋白磷化水平的下调和il-6r、ccr2、cxcr4和mtor的mrna表达水平的下调。以上结果均表明sal损伤的sh-sy5y和u87共培养的条件性培养基中il-6和ccl2的升高和nmsal损伤的sh-sy5y和u87共培养的条件性培养基中il-6和cxcl12的升高,可以诱导jurkat细胞通过t细胞抗原受体(tcellreceptor,tcr)激活mtor信号通路,进行引起细胞的增殖。4.本课题采用内源性神经毒素sal和nmsal损伤的sh-sy5y和u87细胞共培养的条件性培养基对人源原代的外周血淋巴细胞(hpbl)的影响进行研究,对体外研究结果进行验证。结果显示:sal处理的条件性培养基可以诱导hpbl细胞上细胞因子受体il-6r和ccr2mrna水平的表达上调,nmsal处理的条件性培养基可以诱导hpbl细胞上细胞因子受体il-6r和cxcr4的mrna水平的表达上调;sal和nmsal处理的条件性培养基均可以活化hpbl细胞中的mtor信号通路,引起s6k1、4e-bp1、pi3k、akt、mtor蛋白磷酸化水平的升高和mtor的mrna表达水平的上调,进而诱导hpbl细胞的增殖。5.本课题采用内源性神经毒素sal和nmsal损伤的sh-sy5y和u87细胞共培养的条件性培养基对thp1细胞(单核细胞系)的影响进行研究。结果显示:经内源性神经毒素sal损伤的sh-sy5y和u87细胞共培养的条件性培养基可以诱导thp1细胞的增殖。sal可以引起sh-sy5y和u87的共培养的条件性培养基中ccl2细胞因子水平的升高,含有高ccl2细胞因子的条件性培养基可以通过thp1细胞中上调的受体ccr2引起s6k1、4e-bp1、pi3k、akt、mtor蛋白磷酸化水平的升高和mtor信号通路的活化,进而引起细胞的增殖;mtor抑制剂rapamycin可以降低条件性培养基诱导的thp1细胞s6k1、4e-bp1、pi3k、akt、mtor蛋白磷酸化水平,进而抑制其增殖。经内源性神经毒素nmsal损伤的sh-sy5y和u87细胞共培养的条件性培养基可以降低nmsal对thp1的细胞毒性、凋亡水平、氧化应激水平(mda和h2o2)、线粒体膜的肿胀和损伤、凋亡相关蛋白fadd、bax和caspase3的表达和活化水平,进而恢复和维持thp1细胞的功能。6.本课题采用内源性神经毒素nmsal右侧黑质定位损伤wistar雄性大鼠制造pd动物模型,研究特异损伤的多巴胺能神经元细胞对淋巴细胞的影响。对体外实验结果进行体内实验验证。首先对nmsal黑质定位损伤pd大鼠模型的成功与否进行验证,结果表明模型大鼠黑质纹状体区域多巴胺能神经元细胞数量有所减少;同时发生了α-syn蛋白的聚集;并且阿普吗啡可以诱导模型大鼠向健侧(即左侧)旋转行为学的发生。这些结果都表明nmsal右侧黑质定位损伤的pd大鼠模型是成功的。接下来我们对nmsal右侧黑质定位损伤的wistar雄性大鼠的外周血t淋巴细胞进行了研究,结果表明注射了nmsal的大鼠与正常的大鼠和注射pbs的大鼠相比其外周血血浆中的细胞因子cxcl12、il-6和tnf-α的表达水平有所升高;cd3+cd8+t淋巴细胞百分比没有变化,而cd3+cd4+、cd3+tcrvβ8.2/8.4和th2的t淋巴细胞百分比有所增加;同时cd3+cd4+和cd3+cd8+的淋巴细胞增殖速度有所提高;并且t淋巴细胞的s6k1、4e-bp1、pi3k、akt、mtor蛋白磷酸化水平有所升高,mtor信号通路有所活化;提示cd3+cd4+和cd3+cd8+t淋巴细胞增殖可能是通过活化的mtor信号通路实现的。进一步在体内模型中验证了内源性神经毒素特异损伤的多巴胺能神经元细胞可以诱导淋巴细胞通过mtor信号通路进行增殖。本论文研究发现神经毒素特异损伤的多巴胺能神经元细胞与淋巴细胞及单核细胞的的增殖和免疫功能恢复及过度活化密切相关,内源性神经毒素sal和nmsal可以诱导sh-sy5y-egfp、u87和jurkat/hpbl混合培养体系中sh-sy5y-egfp细胞中内源性α-syn蛋白的聚集。sal和nmsal损伤的sh-sy5y和u87细胞共培养的条件性培养基可以通过细胞因子诱导jurkat(淋巴细胞系)/hpbl(人源原代外周血淋巴细胞)的增殖。同时sal损伤的sh-sy5y和u87细胞共培养的条件性培养基可以诱导thp1(单核细胞系)的增殖;而nmsal损伤的sh-sy5y和u87细胞共培养的条件性培养基对thp1细胞的作用与jurkat细胞的作用有所不同,其可以降低nmsal对thp1的毒性作用,进而减少thp1的死亡。外源性神经毒素mpp+损伤的sh-sy5y和u87细胞共培养的条件性培养基对jurkat细胞的作用与sal和nmsal不同,其中高浓度500μmmpp+损伤的sh-sy5y和u87细胞共培养的条件性培养基可以导致jurkat的坏死,低浓度100μmmpp+损伤的sh-sy5y和u87细胞共培养的条件性培养基可以导致jurkat的g2/m期细胞周期的阻滞,进而减少jurkat细胞的数量。实验结果提示sal和nmsal损伤的条件性培养基可以提高单核细胞和淋巴细胞的增殖速度,导致单核细胞和淋巴细胞的过度活化,对多巴胺能神经元细胞造成损伤(如α-syn蛋白的聚集),加速PD的病程进展。而MPP+损伤的SH-SY5Y和U87细胞共培养的条件性培养基可以降低Jurkat(淋巴细胞)的细胞数量,影响其免疫功能,降低机体免疫防护,可能进一步加剧PD的病程进展。本论文的实验结果表明内源性神经毒素Sal和NMSal与外源性神经毒素MPP+损伤的多巴胺能神经元细胞对淋巴细胞的效应不同,提示神经毒素特异损伤的多巴胺能神经元细胞与淋巴细胞或是单核细胞的免疫功能密切相关,同时表明淋巴细胞在多巴胺能神经元α-syn蛋白的聚集过程中发挥一定的作用,为今后研究PD病理机制及其治疗提供一条新的思路。