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背景:肿瘤是多基因参与、逐渐演变的一种疾病,受遗传因素和环境因素的共同调控,基因组不稳定是肿瘤细胞最重要也是最本质的特征。自身基因缺陷或在外界有害因素作用下,会导致基因组不稳定的产生,进而增加了获得性突变的频率。目前已知许多基因的突变与肿瘤密切相关,这些突变在肿瘤的评估和治疗中发挥重要作用。为了更加深入、全面了解各种类型肿瘤的发生发展,对未知的肿瘤相关基因突变的挖掘至关重要。全基因组外显子测序（Exomesuquencing）技术是对人类基因组的外显子进行测序,主要用来发掘罕见变异和孟德尔遗传疾病的致病基因,在发现新的肿瘤相关基因方面得到了广泛应用。我科收入院一位10岁女童,病理确诊为肺右主支气管炎性纤维母细胞瘤。追溯家族史,发现患者的同卵双生双胞胎姐妹身体健康。因同卵双生双胞胎生长环境基本相同,基因相似度高度一致,二人极少量的基因差异可能参与了患者肿瘤的发生。目的:通过全基因组外显子测序发掘可能与患者肿瘤发生相关的基因突变,并研究其机制。方法:（1）为了筛选出患者携带的可能与肿瘤相关的基因,我们取上述双胞胎外周血提取基因组DNA,IlluminaHiseq测序,分析基因组SNPs（Single nucleotide polymorphism）、InDels（Insert and delation）、CNVs（Copy number variations）、SVs（Structuralvariation）等突变,过滤千人基因库（北京诺禾致源生物信息科技有限公司）,保留突变频率低于1/100的突变位点,进一步保留外显子编码区或剪接位点区的变异,去除同义突变后保留对基因表达产物有影响的突变,应用SIFT、Polyphen、MutationTaster、CADD四个软件进一步分析,保留可能有害的突变位点,再以双胞胎中健康者为对照,筛选出患者特有的突变。（2）为了从生物学水平验证筛选出的突变是否是罕见的肿瘤相关基因变异,我们挑选出人群突变率低于1/10^5的基因,分别是FRG1,SETD8,BEGAIN,KIR2DL3,分别设计特异性siRNA,检测在U20S（人骨肉瘤细胞）和HBE（人支气管气道上皮细胞）中敲除各基因后细胞的增殖和凋亡情况,借此锁定可能与肿瘤相关的基因setd8。（3）为了验证SETD8的功能,我们设计了 2条特异性siRNA,在U20S和HBE细胞中敲除SETD8,细胞计数和克隆形成实验检测细胞增殖,β-Gal（细胞衰老半乳糖苷酶染色）检测细胞衰老,流式细胞术检测细胞周期和凋亡,免疫荧光检测细胞的DNA损伤修复反应标志物RPA和.γ-H2AX,DNA fiber检测DNA复制速度和复制叉;将setd8cDNA连接至真核生物载体,在U20S和HBE细胞中过表达SETD8,流式细胞术检测细胞周期,免疫荧光检测DNA损伤修复反应标志物RPA和γ-H2AX。（4）为了验证患者setd8基因上携带的单核苷酸突变对蛋白功能的影响,我们在 U20S 和 HBE 细胞中过表达 wildtype 和 mutant GFP-SETD8,GFP-Trap 拉下GFP-SETD8融合蛋白及和SETD8有相互作用的蛋白,质谱分析和western blot检测H4和H4K20mel的蛋白水平。结果:（1）siRNA分别特异性敲除细胞中的FRG1,SETD8,BEGAIN和KIR2DL3,只有SETD8的缺失引起细胞增殖减慢,凋亡增加,表明SETD8的变异最可能和肿瘤相关;（2）用2条不同的siRINA沉默细胞的SETD8后均出现了细胞增殖的受抑,衰老和凋亡的增加,说明SETD8对细胞活力的维持十分重要;（3）与对照组相比,缺失SETD8的细胞中RPA和γ-H2AX明显增高,说明SETD8的沉默诱导了自发性DNA损伤修复反应;（4）siRNA敲除SETD8后,DNA的复制速度减慢,说明SETD8的缺失对细胞产生了复制压力,发生DNA损伤修复,DNA复制受阻,但是在统计复制叉比率时未发现停滞的复制叉数量增多;（5）WEE1抑制剂干预SETD8缺失的细胞,细胞的增殖受限相较于单纯干预WEE1抑制剂组更加明显,WEE1的抑制和SETD8缺失的叠加也会导致更多的细胞凋亡和DNA损伤修复反应,表明SETD8缺失的细胞对WEE1抑制剂的作用更加敏感;（6）通过外源性过表达wildtype和mutant SETD8,分析和其相互作用的蛋白,表明基因setd8的单核苷酸位点错义突变增强了蛋白SETD8与H4的结合及H4K20mel水平。结论:（1）SETD8通过影响DNA复制和损伤修复反应参与基因组稳定性的维持;（2）Setd8第904位核苷酸的突变增强了蛋白SETD8与H4的结合及H4K20mel水平。（3）下调SETD8可与WEE1抑制剂协同发挥抗肿瘤作用。