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ATP合酶(FoF1-ATPase)是生物体内负责能量转化的酶,现已证明是一个旋转分子马达,包括“定子(ab2δα3β3)”和“转子(γεcu)”两部分。以往对于F0F1—ATPase旋转的单分子研究主要集中于ATP水解驱动的亚基旋转,而对于质子梯度驱动的FoF1-ATPase旋转的应用问题,一直缺乏实验证据。本文建立了质子梯度驱动FoF1-ATFase亚基旋转的研究体系,利用光诱导形成的跨膜质子梯度驱动FoF1-ATPase亚基的旋转进行了下面两方面的研究。具体研究内容如下:
1)跨膜质子梯度驱动的ATP合成需要ATP合酶全酶和质子梯度的参与。我们经过重组得到位于chromatophores膜上的δ亚基缺失的ATP合酶。并将缺失δ亚基的FoF1—ATPase的“定子”和“转子”进行重构:用NaN3和ADPMg2+固定转子γεcn与α3β3之间的相对旋转,得到了新的转子α3β3γεcn.重组chromatophores与肌动蛋白微丝通过biotin-lipid-streptavidin-biotin连接在一起形成一个纳米装置,经过光照,纳米装置的运动通过荧光显微镜观测并通过CCD记录。不同的纳米装置的运动速度大约为2.17-24.43μm/s。它们的运动大部分被CCCP所抑制。这说明纳米装置的运动是由共同作用的质子动力势所驱动的。从生物工程学的观点来看,FoF1-ATPase的协同作用在将来是一个非常有意义的研究领域。
2)对缺失δ亚基的FoF1-ATPase作为生物传感器检测禽流感病毒进行了初步探索。ATP合酶β亚基的旋转已经由连接在其上面标记了荧光的肌动蛋白微丝的旋转通过荧光显微镜观测到。并且在我们以前的工作中,我们注意到位于chromatophores膜上的δ-亚基缺失的FoF1-ATP酶可以被用作光驱动的生物分子马达来用于实验体系中,并且反应的启动不用另外加入ADP。为了利用这样一个体系来检测病毒,我们构建了一个新型的生物传感器。我们将抗体-生物素-链亲和素-生物素-抗体系统连接到δ-free FoF1-ATPase的α和β亚基上。利用对pH变化敏感的量子点标记chromatophores外表面。通过荧光强度变化表征光照后形成的质子动力势引起的质子向chromatophores外部的转运并通过BPCL系统及时检测。当在chromatophores上连接不同的负载时,荧光强度变化受到不同程度的影响。因此量子点标记的重组的chromatophores可用于研究FoF1-ATPase的质子转运活性；这个体系经过进一步完善将具有应用前景。