榨菜（芥菜，Brassica juncea）是我国特产蔬菜，也是我国重要的经济作物，由于芥菜类作物自交亲和指数非常高，细胞质雄性不育系成为榨菜杂种优势利用的关键技术。细胞质雄性不育（Cytoplasmic male sterility，CMS）是一种不能产生花粉的母性遗传形状，被广泛用于作物杂种优势的利用。对细胞质雄性不育及其育性回复机制的研究可为杂种优势利用提供理论基础，同时为人工创制细胞质雄性不育系及育性调控提供理论指导。课题组之前研究中，鉴定到了榨菜细胞质雄性不育相关基因ORF220。本研究运用遗传学、分子生物学和生物化学等手段，以榨菜（Brassicajuncea var.tumida Tsen et Lee）细胞质雄性不育系及其育性回复突变系、保持系及其MSH1-RNAi转基因系为材料，系统研究了调控线粒体基因组重组关键基因MSH1与榨菜胞质不育相关基因ORF220亚化学计量变化及与育性转变的关系，从基因组水平上解析了细胞核基因调控细胞质雄性不育发生及育性回复突变的机制。本研究主要研究成果如下:　　1.鉴定到榨菜CMS系的育性回复突变系，发现了CMS及育性回复突变系中线粒体基因组重组证据。在39株自交CMS植株中获得了53株后代植株，其中有两株经鉴定为育性回复突变系。发现在CMS、育性回复突变系及保持系中，ORF220发生了亚化学计量变化，当ORF220以高拷贝数存在时，表现为不育，当ORF220以低拷贝数存在时，表现为可育。并且，ORF220的亚化学计量变化调控了ORF220转录和翻译水平的相应表达变化。对CMS和育性回复突变系的线粒体基因组ORF220及其两侧区域进行比较发现，在ORF220及其两侧发生了线粒体基因组重组现象。此外，CMS与其育性回复突变系的atpA，nad2，rps7，ORF322，ORF286，ORF261等基因位点也发现了线粒体基因组水平上差异，表现出线粒体基因组的重组现象。因此，线粒体基因组重组导致的ORF220的亚化学计量变化与榨菜育性回复相关。　　2.线粒体定位表达榨菜CMS相关基因ORF220导致雄性不育发生。我们构建了组成型(35S)及花器官特异性启动子(AP3)驱动的ORF220线粒体定位表达及非线粒体定位表达载体，遗传转化至拟南芥，发现无论是组成型表达还是花器官特异性表达，ORF220在拟南芥中线粒体定位表达导致细胞质雄性不育。另外我们还构建了组成型启动子驱动下的ORF220(1-91)和ORF220(92-220)线粒体定位表达载体，遗传转化至拟南芥表明，ORF220(1-91)可能是ORF220生物功能的关键区域。　　3.发现了MSH1基因抑制表达后改变了ORF220亚化学计量，导致雄性不育发生。发现在榨菜基因组中存在两个MSH1基因，其氨基酸序列与拟南芥的MSH1氨基酸序列具有很高的相似性，通过农杆菌介导的遗传转化，获得了榨菜MSH1-RNAi转基因系。在榨菜四个独立MSH1-RNAi转基因系中，MSH1表达受到不同程度抑制，在其中两个独立转基因系后代中发现细胞质雄性不育植株，且ORF220的亚化学计量变化及其相应的表达变化伴随着雄性不育的发生。这些结果表明榨菜保持系中MSH1的抑制表达可以导致ORF220亚化学计量变化及雄性不育的发生。　　4.研究了MSH1在育性回复过程中的调控作用。发现在CMS系植株开花过程中，MSH1在后期的花蕾中出现不同程度的下调表达。同时在CMS开花后期的单个花蕾中观察到了ORF220的亚化学计量变化现象，而在开花前的花蕾中没有发现。以上结果表明，MSH1在育性回复过程中可以通过调控ORF220亚化学计量变化来调控育性回复。　　5.通过细胞质雄性不育系、育性回复突变系、保持系及其雄性不育MSH1-RNAi转基因系的花粉发育相关基因表达分析，发现了花粉发育相关基因表达模式与育性转变的相关性。首先通过比较CMS及其育性回复突变系花蕾转录组，鉴定到在育性转变过程中差异表达的花粉发育相关基因，然后研究了CMS及其育性回复突变系、保持系及其雄性不育MSH1-RNAi转基因系中花粉发育相关基因的表达模式。发现在育性回复突变系中花粉发育相关基因相比于CMS上调表达，伴随着不育到可育的转变，而在雄性不育MSH1-RNAi转基因系中相比于其保持系下调表达，伴随着可育到不育的转变。这些结果表明，MSH1介导的育性回复突变及雄性不育发生过程中，ORF220的亚化学计量变化与花粉发育相关基因表达及育性转变相关，证实了线粒体基因组行为与花粉发育过程的相关性。　　基于以上结果，我们提出了榨菜MSH1通过ORF220亚化学计量变化导致细胞质雄性不育发生及育性回复突变的调控机制。MSH1抑制线粒体基因组重组介导的ORF220亚化学计量变化，当ORF220由低拷贝数变为高拷贝数时，导致细胞质雄性不育的发生，反之，则导致育性回复突变。同时，ORF220的亚化学计量变化通过未知的线粒体反向调控信号导致细胞核花粉发育相关基因表达的下降或者上升，从而调控榨菜育性转变。