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西藏是我国特殊的黑木耳产区,西藏独特的环境条件赋予了高原黑木耳抗逆性强、耐低温、抗病虫害、生长周期短、营养价值高、价格昂贵等特点。将西藏优良黑木耳菌种引入全球产量最大的黑龙江省,优化该地区黑木耳种质资源,提高黑木耳产量和内在品质,挖掘黑木耳新的药用及保健成分,对进一步做强黑木耳产业具有重要意义。本研究从西藏高原特殊环境中采集黑木耳菌种,在黑龙江省筛选、驯化,将优良菌种推广栽培,并对其子实体中的凝集素药用活性进行研究。
在对西藏优良黑木耳菌种的选育中,首先在西藏林芝市六个区域及黑龙江省七台河市勃利县共采集7株野生黑木耳子实体,通过组织分离的方法得到了7株黑木耳的一级菌种。对一级菌种进行了拮抗试验、菌种栽培出耳试验,并对子实体的品质、微量元素和功能性成分分析,确定了西藏6号为最优黑木耳菌株;对西藏6号的ITS序列测定分析,确定西藏6号为黑木耳新菌种;并对西藏6号的种植效益进行分析,西藏6号产量可达到57.5±0.22g/袋。
探索黑木耳中活性成分凝集素的最佳提取条件,采用单因素试验和响应面的方法,对提取时间、提取温度和料液比三个条件进行优化。结果表明:在浸提时间为8.47h,料液比为1∶51.71,(NH4)2SO4浓度为50.23%时,粗提液中的凝集活性最高,可得最大理论值为5.4795HU。
探索凝集素对乳腺癌细胞MCF-7的体外抑制作用,采用CCK-8试剂探究黑木耳凝集素对MCF-7的增值影响;采用形态学观察细胞的形态学变化;采用划痕法探究凝集素对MCF-7的迁移率影响;采用ELISA法探究细胞增殖中关键酶TOP1和TDP1的含量;采用RT-PCR技术研究黑木耳凝集素对癌细胞增殖中关键酶TOP1和TDP1转录水平的影响。结果表明:当凝集素的浓度为50μg/mL时,细胞存活率与阴性对照出现显著差异,处理24h时为90.21±2.44(%),处理48h时为87.74±2.36(%);随着凝集素浓度的增大,细胞数量减少,贴壁疏松,细胞间连接松散,呈现凋亡前体状态;黑木耳凝集素可抑制MCF细胞迁移率;随着凝集素浓度的提升,MCF-7细胞中TOP1和TDP1基因转录减少,且细胞内含量减少。
本研究选育出了一株适合在黑龙江省栽培的高产、子实体品质优良的高原黑木耳新菌种。并对黑木耳中研究报导较少的活性成分凝集素确定了最优提取条件,并确定了黑木耳凝集素可以通过抑制乳腺癌细胞中关键酶TOP1和TDP1的转录及表达来达到抑制乳腺癌细胞增殖的作用。本课题的完成,为黑龙江地区选育出一株优良高原黑木耳菌种,使西藏黑木耳可以在黑龙江省充分发挥其资源优势,释放优良潜质,增加黑龙江省菌农的收入,也为其他食用菌(如羊肚菌、松茸、蘑菇等)提供育种新模式。黑木耳凝集素的研究丰富了黑木耳化学成分的种类,并对生物活性加以补充,为黑木耳的食药用研究提供理论基础。
在对西藏优良黑木耳菌种的选育中,首先在西藏林芝市六个区域及黑龙江省七台河市勃利县共采集7株野生黑木耳子实体,通过组织分离的方法得到了7株黑木耳的一级菌种。对一级菌种进行了拮抗试验、菌种栽培出耳试验,并对子实体的品质、微量元素和功能性成分分析,确定了西藏6号为最优黑木耳菌株;对西藏6号的ITS序列测定分析,确定西藏6号为黑木耳新菌种;并对西藏6号的种植效益进行分析,西藏6号产量可达到57.5±0.22g/袋。
探索黑木耳中活性成分凝集素的最佳提取条件,采用单因素试验和响应面的方法,对提取时间、提取温度和料液比三个条件进行优化。结果表明:在浸提时间为8.47h,料液比为1∶51.71,(NH4)2SO4浓度为50.23%时,粗提液中的凝集活性最高,可得最大理论值为5.4795HU。
探索凝集素对乳腺癌细胞MCF-7的体外抑制作用,采用CCK-8试剂探究黑木耳凝集素对MCF-7的增值影响;采用形态学观察细胞的形态学变化;采用划痕法探究凝集素对MCF-7的迁移率影响;采用ELISA法探究细胞增殖中关键酶TOP1和TDP1的含量;采用RT-PCR技术研究黑木耳凝集素对癌细胞增殖中关键酶TOP1和TDP1转录水平的影响。结果表明:当凝集素的浓度为50μg/mL时,细胞存活率与阴性对照出现显著差异,处理24h时为90.21±2.44(%),处理48h时为87.74±2.36(%);随着凝集素浓度的增大,细胞数量减少,贴壁疏松,细胞间连接松散,呈现凋亡前体状态;黑木耳凝集素可抑制MCF细胞迁移率;随着凝集素浓度的提升,MCF-7细胞中TOP1和TDP1基因转录减少,且细胞内含量减少。
本研究选育出了一株适合在黑龙江省栽培的高产、子实体品质优良的高原黑木耳新菌种。并对黑木耳中研究报导较少的活性成分凝集素确定了最优提取条件,并确定了黑木耳凝集素可以通过抑制乳腺癌细胞中关键酶TOP1和TDP1的转录及表达来达到抑制乳腺癌细胞增殖的作用。本课题的完成,为黑龙江地区选育出一株优良高原黑木耳菌种,使西藏黑木耳可以在黑龙江省充分发挥其资源优势,释放优良潜质,增加黑龙江省菌农的收入,也为其他食用菌(如羊肚菌、松茸、蘑菇等)提供育种新模式。黑木耳凝集素的研究丰富了黑木耳化学成分的种类,并对生物活性加以补充,为黑木耳的食药用研究提供理论基础。