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青花菜(Brassica oleracea L.var.italica)是一种重要的全球性蔬菜,其富含多种营养成分和防癌物质,深受广大消费者喜爱。青花菜具有明显的杂种优势,细胞质雄性不育系利用已成为杂交育种的主要方式。然而关于青花菜雄性不育的发生机理以及相关基因(包括编码蛋白基因和miRNA等)在该过程中的功能尚不明确。高温和高盐对于青花菜的生长极为不利,可严重影响其产量和品质。因此,研究青花菜在这两种逆境条件下的响应机制具有非常重要的意义。本研究以青花菜为试验材料,利用高通量测序技术,鉴定育性相关基因和miRNA,分析其时空表达特性,为构建青花菜育性相关miRNA与编码蛋白基因的调控网络奠定基础。同时鉴定青花菜在高温和盐胁迫下差异表达的长链非编码RNA(Long non-coding RNA,LncRNA),研究它们在胁迫下的动态变化模式,分析部分差异表达LncRNAs在花粉发育过程中的作用。研究的主要结果如下: 1.显微观察显示青花菜不育系与保持系存在明显的细胞学差异。基于转录组测序技术成功构建两个基因文库,获得了145个下调和73个上调的青花菜差异表达基因。差异基因功能注释表明它们参与了青花菜雄性不育发生过程中的糖代谢、脂代谢、谷胱甘肽代谢和富含半胱氨酸的蛋白质代谢等。 2.对青花菜不育系和保持系的花蕾进行sRNA测序,结果在两个sRNA文库中筛选得到181个保守miNRA和8个新型miRNA,其中48个miRNA的表达存在差异。这些差异表达miRNA与其对应的靶基因共同参与了雄性不育发生过程中的细胞形态构成、转录调控、信号转导、激素响应和多种代谢过程。 3.基于RNA-seq测序技术,在青花菜高温和盐胁迫处理的5个文库中鉴定到2,432条LncRNAs,其中158条为差异表达LncRNAs。cis和trans靶基因预测分析显示,这些差异表达LncRNAs介导了青花菜的氧化磷酸化、激素信号转导以及脂肪酸延伸和代谢等过程。同时分析了青花菜高温和盐胁迫相关LncRNAs在青花菜不育系和保持系花蕾中的表达特征,结果发现7个LncRNAs可能同时参与了青花菜高温/盐胁迫及雄性不育发生过程。 4.使用qRT-PCR技术分析了8个候选miRNA内参基因在青花菜花蕾不同器官和不同发育时期中的表达特征。结果发现8个候选内参基因在器官组和发育组中的表达水平各不相同。通过geNorm、Normfinder和BestKeeper软件对其表达稳定性进行综合分析,得出U6和5S分别在青花菜花蕾4个不同器官以及不育系和保持系花蕾3个不同发育时期的表达最稳定,可作为研究青花菜花蕾发育相关miRNA的适宜内参基因。