研究背景及意义近年来,全球范围内热浪发生频率和强度逐年增加,每年数以千计的人群遭受热应激性疾病(Heat stress illness,HSI)的威胁。热射病(heat stroke,HS)是一种最为严重的HIS,也被称作重症中暑,主要临床表现为核心体温(core temperature,Tc)增高达40℃以上,同时合并存在中枢神经系统(center nerve system,CNS)异常以及多器官功能障碍。HS的死亡率非常高,国内外报道为10%—50%,严重威胁着人们的健康。军人是热射病的高发人群,每年均有因中暑而导致官兵伤亡的案例报道,尤其是在热区部队执行任务时,HS的发病率可显著升高,且由于部队训练演习时常在野外条件,救治条件有限,若未得到及时有效的救治,死亡率可高达30%—50%。因此,预防HS等热损伤,对维护热环境军事作业人员的健康,提高热区部队战斗力具有重要意义,也是热区部队常规卫生保障的重要内容之一。热习服(heat acclimation,HA)是热区部队开展热损伤预防的重要措施,且我国于1996年就颁发了《军人耐热锻炼卫生规程》,规定赴热区和驻扎在热区部队执行重大任务前必须进行耐热锻炼。HA是指机体在长期反复的热作用下出现的一系列适应性反应,表现在机体对热的反射性调节机能更趋完善,各种生理机能达到一个新的水平,如出汗率增加而心率和中心体温相对下降,代谢率降低,即机体散热增加而产热减少。中枢神经系统损害是热射病的主要临床特征之一,也是热射病神经系统后遗症的主要病理原因。有研究显示,HA可减低神经系统对损伤刺激的应激性,但HA对HS导致的神经损伤是否具有直接保护作用,目前相关研究报道较少。因此,探讨HA对HS导致的脑损伤的神经保护作用及可能的机制,对HS的预防和救治具有重要意义。自噬(autophagy)是一种高度保守的细胞生物学行为,即细胞内存在“自己吃自己(self-eating)”的现象。当存在对细胞生存不利的诱发因素时,如细胞外的营养缺乏、缺血、缺氧、高热等和细胞内的蛋白折叠错误、蛋白质聚集、代谢紊乱、细胞器衰老或破裂等,均可诱导细胞发生自噬。自噬主要参与细胞内大分子物质的循环及再利用、受损细胞器的清除,在促进细胞存活,维持细胞内稳态,保持细胞健康过程中起着重要作用。在神经元中,通过自噬清除胞质中有神经毒性的蛋白聚集物,从而对神经系统损伤起到保护性作用。但目前研究显示,当自噬被过度激活或自噬上调不受控制时,自噬可通过激活凋亡途径或由于细胞无法及时有效降解大量细胞内容物而加速细胞死亡,称为自噬性程序性细胞死亡。ha与hs均是由外界高温环境刺激产生的,不同的是形成ha的条件是长时间反复的温和热刺激,而形成hs的条件是在短时间内遭受了致死性高强度热刺激,而ha与hs对机体产生的生理效应完全不同,由此我们推测这两种不同程度的热刺激对自噬的影响也并不相同,且其诱导的自噬变化在ha及hs的病理生理调节中的作用和机制可能也不相同。在自噬发生过程中,自噬体包裹需要降解的内容物后与溶酶体融合形成自噬溶酶体,利用溶酶体内的组织蛋白酶和水解酶进行降解消化,最终实现细胞内物质循环。由此可见,溶酶体的功能在自噬过程中起着关键作用,而细胞遭受应激发生损伤时,也可能累及到溶酶体的功能。那么,在热习服和热射病两种不同强度的应激状态下,溶酶体的功能是否有差异及其与自噬调节有怎样的关系,目前研究尚未阐述清楚。因此,本课题通过探讨ha对hs导致的脑损伤的保护作用及自噬溶酶体途径在其中所发挥的作用,以揭示ha神经保护作用的机制,为hs的防治提供新的参考依据。研究方法1.采用8周龄健康雄性c57bl/6小鼠在(34.5±1.0)℃、湿度(70±5)%条件下连续暴露30d建立ha小鼠模型,在(43±0.5)℃、湿度(70±5)%条件下暴露120min建立hs小鼠模型。将小鼠随机分为正常对照组(con组)、热习服组(ha组)、热射病组(hs组)和热习服+热射病组(ha+hs组)。2.通过观察不同组别小鼠的一般行为学、肛温变化、脑组织含水量、脑组织病理改变和神经细胞变性与凋亡情况,探讨热习服对热射病脑损伤的保护作用。3.通过观察不同组别小鼠脑组织的自噬相关蛋白lc3和beclin-1的表达和自噬体形成情况,并应用自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine,3ma)进行干预,探讨自噬在热习服对热射病脑损伤保护作用中的影响。4.通过检测不同组别小鼠脑组织的溶酶体相关膜蛋白1(lamp-1)和组织蛋白酶b(cathepsinb)的表达和活性情况,探讨溶酶体功能在自噬调节中的作用。结果1.采用(34.5±1.0)℃、湿度(70±5)%连续暴露30d和(43±0.5)℃、湿度(70±5)%暴露120min可分别建立ha小鼠模型和hs小鼠模型,为后续研究提供了实验基础。2.热习服对热射病导致的脑损伤具有保护作用,主要表现在:经ha预处理后,接受43℃高温暴露时,小鼠的一般行为状态较好,耐热能力显著增强,其最高肛温、死亡率、脑组织含水量、神经细胞病理损伤程度以及神经细胞的凋亡和变性程度均显著低于未经HA预处理的小鼠,差异均具有统计学意义(均P<0.05),HA组小鼠的上述指标与CON组小鼠相比,差异均无统计学意义(均P>0.05)。结果说明HA对HS导致的中枢神经损伤具有明显的保护作用,且HA本身对神经系统未产生损害效应。3.与CON组相比,HA组、HS组和HA+HS组的自噬相关蛋白LC3和Beclin-1的表达和自噬体形成均显著升高,差异均具有统计学意义(均P<0.05),提示热刺激可诱导小鼠中枢神经细胞自噬增强。与HS组相比,HA+HS组的自噬相关蛋白LC3和Beclin-1的表达和自噬体形成均明显下降,差异均具有统计学意义(均P<0.05),提示热习服预处理下调了HS组损伤性热刺激诱导的自噬水平。应用自噬抑制剂3MA后,3MA组和HA+3MA组的自噬水平受到了抑制,但脑组织含水量、神经元变性和凋亡程度未发生明显改变,提示3 MA本身不会造成脑组织损伤;HA+3MA+HS12h组的自噬水平受到了抑制,但其脑组织含水量显著升高、神经元变性和凋亡程度明显加重,提示抑制自噬后,HA预处理对HS导致的脑损伤保护作用减弱;3MA+HS12h的自噬水平仍然维持在较高水平,且其脑组织含水量、神经元变性情况和凋亡情况与HS组比较均未发生明显改变,提示自噬抑制剂对HS12h组小鼠的自噬程度和损伤效应未发挥明显作用。4.HA组小鼠脑组织细胞中溶酶体相关膜蛋白-1(LAMP-1)和组织蛋白酶B(Cathepsin B)的表达量与活性均略高于CON组,而HS组的LAMP-1和Cathepsin B的表达量与活性均显著低于CON组(P<0.05),提示损伤性高温刺激可破坏溶酶体的结构和酶的活性,从而影响溶酶体的功能。与HS组相比,HA+HS组中的LAMP-1和Cathepsin B的表达量与活性明显升高,尤其是在恢复早期,差异更为明显,提示热习服预处理减轻了热射病对溶酶体的损伤。全文结论1.热习服对热射病脑损伤具有保护作用;2.热习服通过调节损伤性热刺激诱导的自噬水平对热射病神经系统损伤发挥保护作用;3.自噬溶酶体途径在热习服保护热射病脑损伤中发挥了重要作用。热射病损伤性热刺激破坏了溶酶体的正常功能,而热习服可适当上调溶酶体的功能。