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目的:建立氡染毒和p53敲除人支气管上皮细胞恶性转化模型,探讨p53在氡致人支气管上皮细胞恶性转化过程中,能量代谢途径的改变及其分子机制。方法:(1)利用TALEN技术建立p53敲除人支气管上皮细胞模型。(2)建立氡染毒人支气管上皮(BEAS-2B)细胞和p53敲除人支气管上皮(p53 KO)细胞恶性转化模型。细胞接种于Transwell培养皿置于HD-3型多功能氡室,氡染毒浓度为20000 Bq/m3,染毒时间20 min/次,细胞每次氡染毒后培养3-4天,传代后再进行下一轮氡染毒,重复染毒20次。每5代进行一次细胞增殖活性、软琼脂克隆形成、细胞侵袭和迁移能力的检测。(3)在氡暴露致细胞恶性转化的不同阶段(5、10、15、20、25代),采用生化法检测葡萄糖消耗量、乳酸含量、乳酸脱氢酶含量;采用Seahorse XF细胞外流量分析仪检测细胞氧耗量;采用化学发光法检测ATP含量;real-time PCR检测细胞线粒体DAN拷贝数;JC-1荧光探针流式细胞仪检测细胞线粒体膜电位;Western blot检测p53、SCO2、TIGAR、三羧酸限速酶(IDH3A、SDHA)、糖酵解限速酶(HK-II、PFKM、PKM2)的蛋白表达水平。结果:(1)基因测序结果TALEN靶点目的片段出现突变,western blot未检测出p53蛋白表达,证实p53基因敲除细胞模型建立成功。(2)与野生型p53BEAS-2B细胞和p53基因敲除细胞p53 KO细胞相比,氡染毒后BEAS-2B-Rn和p53 KO-Rn细胞的软琼脂克隆集落数、细胞侵袭能力和细胞迁移率明显升高,细胞倍增时间不同程度减少。同时,BEAS-2B细胞在氡染毒后第20代开始出现恶性转化,而p53 KO细胞则提前了5代,即从第15代开始即出现恶性转化表型。(3)氡染毒致细胞恶性转化过程中,细胞的葡萄糖消耗量明显增加,乳酸和LDH的含量上升,ATP合成增多,而细胞氧耗量降低。氡染毒BEAS-2B-Rn细胞从第10代开始mtDNA拷贝数增加,并随着传代次数增多而升高。敲除p53基因的p53 KO细胞mtDNA拷贝数和MMP均明显下降,当p53 KO-Rn细胞传至15代出现恶性转化表型时,mtDNA拷贝数显著低于相应传代的BEAS-2B-Rn细胞。同时,MMP明显下降。(4)在BEAS-2B-Rn细胞中,P53蛋白的表达量从第15代时出现下降。氡染毒早期,BEAS-2B-Rn细胞中SCO2和TIGAR的蛋白表达量无明显改变,但在20代时出现蛋白表达量的下降。在p53 KO细胞中,SCO2和TIGAR蛋白表达量低于BEAS-2B细胞,染氡后SCO2蛋白表达持续增加,从第20代开始出现下降,TIGAR蛋白则在染氡后无明显变化。(5)氡染毒后的BEAS-2B-Rn细胞从20代开始IDH3A和SDHA蛋白的表达量下降,p53敲除后SDHA表达明显下降,但对IDH3A表达无影响。在氡染毒早期,BEAS-2B-Rn细胞HK-II蛋白表达增加,并持续到25代。PFKM蛋白则从20代开始表达量增加。PKM2蛋白从第15代开始,随着染氡时间的延长,表达量逐渐升高。p53 KO细胞PFKM蛋白表达高于BEAS-2B细胞;在p53 KO-Rn细胞中,HK-II、PFKM和PKM2的表达未发生相应的改变。结论:(1)成功建立了p53基因敲除的人支气管上皮细胞模型;(2)成功建立了氡染毒致人支气管上皮细胞恶性转化的模型;(3)利用上述模型,研究了氡致细胞恶性转化过程中能量代谢的分子改变,发现氡照射诱导的细胞恶性转化,是线粒体损伤、能量代谢途径改变和p53功能丧失综合作用的结果。P53对线粒体能量代谢的失调是氡致细胞恶性转化中的重要影响因素。