黄梁木木质部细胞激光显微切割技术体系的建立

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黄梁木(Neolamarckia cadamba)是热带亚热带地区广泛分布的茜草科团花属速生阔叶树种,不仅生长十分迅速而且材质致密。其快速生长依赖于包括初生木质部和次生木质部在内的整个木质部细胞的发育进程,因此,解析木质部细胞生长与发育的分子调控机制对于促进热带亚热带速生树种的遗传改良与应用具有十分重要的作用。然而,在木本植物中尤其是速生树种中如何获得高质量的特定组织或细胞仍然是一道技术难题。激光显微切割技术可以在显微镜下利用激光束从异质细胞中精确定位、分离并收集诸如木质部等特异组织或细胞,并结合RNA-Seq分析出特异表达基因,为解析木质部细胞生长与发育机理提供技术支撑。本论文利用激光显微切割技术对如何高质量获取黄梁木茎段的木质部细胞开展研究,建立和优化了黄梁木不同实验材料的显微切割技术参数,获得了高质量的黄粱木木质部细胞RNA。主要结果如下:1、对黄梁木试管苗和田间苗进行冰冻切片,最终采用液氮冰冻后半包埋方式即可获得大量四月龄黄梁木田间苗茎段形态结构完整和高质量RNA的切片。2、黄梁木温室苗不同茎节的石蜡切片表明第二茎节是初生木质部到次生木质部生长的转换节点,从而弄清了黄梁木初生生长到次生生长的发育转换的关键部位,为精确获取木质部细胞奠定了技术基础。3、以黄梁木幼苗第二茎段为基准。成功摸索出适合黄梁木茎段木质部细胞的激光显微切割参数,并收集了黄梁木第一、二、四茎段的木质部细胞。经过优化的激光参数为:power(能量)37、Aperture(孔径)1、Speed(速度)7、Head Current(发射强度)100%、Pulse Frequency(脉冲频率)1101。采用Rneasy Micro kit(Qiagen)试剂盒提取木质部细胞的总RNA,经Agilent 2100 Bioanalyzer检测,所有样品的rRNA Ratio[25S/18S]大于1.2,RNA Integrity Number[RIN]大于6.1,均可用于转录组建库测序。
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