目的遗传性球形红细胞增多症(Hereditary Spherocytosis, HS)是一种常见的遗传性溶血性疾病,以贫血、黄疸和脾肿大为特点,外周血涂片中可见球形红细胞增多。HS临床表现、分子基础和遗传方式具有显著异质性。HS发病机制是基因突变导致红细胞膜蛋白缺陷。目前己发现5种致病基因ANK1, SLC4A1, SPTA1, SPTB和EPB42,分别编码锚蛋白,带3蛋白,α-收缩蛋白,β-收缩蛋白和4.2蛋白。欧美国家对于SLC4A1基因进行突变分析,发现有错义、无义、插入、缺失等突变。虽然国内对该病的病例报道不少,但对带3蛋白SLC4A1基因进行突变检测的报道较少。对HS研究的常用方法主要是凝胶电泳对膜蛋白进行缺陷分析和DNA直接测序。然而,SDS-PAGE和Western Blot技术对膜蛋白分析的灵敏度一般。本研究利用SDS-PAGE电泳和Western Blot技术,先明确HS患者红细胞膜蛋白缺陷类型；再结合DNA直接测序技术对SLC4A1基因全部外显子和其相邻内含子进行突变分析。然后对其家系成员进行突变位点验证,以了解患者SLC4A1基因的突变形式,初步探讨中国带3蛋白缺陷的HS患者分子发病机制,进一步为患者提供遗传咨询和优生优育指导服务。方法本研究收集5个带3蛋白缺陷的HS患者及其家系成员的外周血,运用传统方法提取患者红细胞膜蛋白；利用SDS-PAGE电泳和Western Blot技术分析患者红细胞膜蛋白缺陷的类型；按照DNA试剂盒方法提取患者外周血DNA；针对缺陷带3蛋白(SLC4A1基因)设计并合成相应引物,通过PCR扩增得到目的产物。使用DNA直接测序技术对SLC4A1基因全部外显子及其相邻内含子进行突变分析,并与NCBI数据库内标准序列进行比对,分析和探讨基因突变类型。然后对其家属成员进行SLC4A1基因相关突变位点验证,以了解患者SLC4A1基因的突变形式,并初步探讨中国带3蛋白缺陷的HS患者分子发病机制。结果经SDS-PAGE和Western Blot技术分析5个家系均为带3蛋白缺陷,对带3蛋白SLC4A1基因进行DNA测序发现均有突变,结果如下：先证者1为带3蛋白部分缺陷,SLC4A1基因有2个突变：第一个突变是位于4号外显子点突变c.113A>C突变,Asp38→Ala38 (D38A),为错义突变； 第二个突变是SLC4A1基因6号内含子c.349+27C>T(IVS6nt+27C>T)。先证者2为带3蛋白部分缺陷,SLC4A1基因有2个突变：第一个突变是位于13号外显子点突变C.1540C>T, Cys514 →Arg514 (C514R),为错义突变；第二个突变是7号内含子c.609+86G>A(IVS7nt+86G>A)。先证者3为带3蛋白部分缺陷,SLC4A1基因有2个突变：第一个突变是位于4号外显子点突变c.113A>C, Asp38→Ala38 (D38A),为错义突变；第二个突变是位于6号内含子C.349+27C>T (IVS6nt+27C>T)。先证者4为带3蛋白部分缺陷,SLC4A1基因4号外显子有2个突变：第一个突变是位于4号外显子点突变c.113A>C, Asp38→Ala38 (D38A),为错义突变；第二个突变是位于4号外显子点突变c.166A>G, Lys56→ Glu56 (K56E),为错义突变。先证者5为带3蛋白部分缺陷,SLC4A1基因4号外显子点突变c.166A>G, Lys56→Glu56 (K56E),为错义突变。结论1.本研究成功运用Western Blot方法研究HS患者膜蛋白缺陷类型,Western Blot和SDS-PAGE考马斯亮蓝染色两种方法同时检测能更明确膜蛋白缺陷类型。2.HS突变位点分布散在,即使是同一蛋白缺陷,不同家系的HS患者几乎都有自己的突变类型。但同一个家系的HS患者表现为相同的突变方式。3.此研究表明,在我们所研究的中国人群中大部分HS患者以带3蛋白缺陷为主。