研究背景和目的大肠癌是常见的恶性肿瘤之一。近年来，我国大肠癌的发病率和死亡率呈逐年上升趋势，转移是导致其死亡的重要原因。探讨大肠癌转移相关因素，筛查转移特异性基因，为临床抗转移治疗提供理想的药物靶点是当前大肠癌研究的热点。癌转移是一个复杂的、多步骤、多因素过程，肿瘤细胞必须全部完成下列环节才能形成转移灶：(1)从原发瘤母体脱落；(2)进入血管或淋巴管；(3)迁移到靶器官；(4)从血管或淋巴管中游出；(5)在靶器官实质组织中生长形成新的肿瘤结节。此过程中的每个步骤均对瘤细胞有限制作用。肿瘤的异质性是癌转移的根本原因，虽然大多数肿瘤是单克隆起源的，但由于肿瘤的遗传学不稳定性和靶器官的选择作用，肿瘤表现为一个不断变异的群体。出现一些具有转移表型的瘤细胞亚群可以在某些特定的靶器官中优势生长，它们与原发瘤细胞相比，具有某些特殊的性状。如果找到这些机制，设计相应的阻断靶点，即可能抑制转移。介于转移连续复杂的过程，人们将其划分为若干步骤。针对不同的研究对象，采用不同的方法在不同的研究水平上分别进行研究。但是，关于转移课题的实验性研究，无论在哪个研究水平上的工作，都与动物实验密不可分。因此，建立实验动物转移模型在肿瘤转移研究中占有十分重要的地位。T淋巴瘤侵袭转移诱导因子1(Tiam1，T-lymphoma invasion and metastasis gene 1)是Habets等于1994年从鼠T淋巴瘤细胞高侵袭变异株中分离，而后在人体定位于第21号染色体q22.11带的基因。Tiam1主要在人大脑和睾丸组织中表达，其他组织中不表达或低表达，但各种不同组织来源的肿瘤细胞中均有表达。在乳腺癌、肺癌及Ras诱导的皮肤癌等多种肿瘤中证实，Tiam1基因具有明显促进肿瘤发生、演进和转移的作用。我们前期研究结果显示，Tiam1蛋白表达与大肠癌转移高度相关。对大肠癌转移细胞株及组织标本检测Tiam1基因表达情况，发现Tiam1表达弱或阴性者转移的发生率低，表达强者其转移发生率高。应用半定量RT-PCR检测Tiam1在大肠癌转移性细胞株表达阳性率为100％，Northern点杂交和原位杂交结果也证实Tiam1基因在高转移细胞株及浸润转移癌组织中高表达；通过基因转染方法将Tiam1导入内源性几乎不表达该基因的人大肠癌细胞HT29，结果显示其成瘤及转移能力明显增强；通过RNAi方法高效、特异性地抑制大肠原发癌建系的SW480细胞的Tiam1基因表达，皮下成瘤实验发现其体内增殖能力显著降低。为进一步确定Tiam1与大肠癌转移的关系，采用本科室成功建系的人大肠癌细胞亚株SW480／EGFP~+和SW480／EGFP~+／Tiam1~-通过尾静脉注射和瘤块结肠原位接种技术，建立可视化裸鼠血行与自发转移模型，模拟大肠癌转移过程，观察Tiam1基因沉默对大肠癌转移中的影响，为大肠癌转移机制的研究提供理想的动物模型和实验依据。方法1．人大肠癌：SW480细胞亚株的鉴定培养本科室成功建系的人大肠癌细胞亚株SW480／EGFP~+和SW480／EGFP~+／Tiam1~-。应用倒置荧光显微镜检测两株细胞绿色荧光蛋白的表达；免疫细胞化学及Western blot检测比较两株细胞中Tiam1蛋白的表达水平；MTT法测定细胞生长曲线检测比较两株细胞的体外增殖能力。2．尾静脉注射大肠癌血行转移可视化动物模型的建立分别消化收集SW480／EGFP~+和SW480／EGFP~+╱Tiam1~-细胞，以2×10~5个细胞／0.2ml／只与2×10~6个细胞／0.2ml／只两个级别量尾静脉注入裸鼠体内。2m后处死裸鼠，整体荧光体视镜下解剖观察裸鼠成瘤及转移情况，按常规病理取材。3．结肠原位接种自发转移可视化动物模型的建立分别将SW480／EGFP~+和SW480／EGFP~+／Tiam1~-细胞悬液(1×10~7／0.2ml／只)在裸鼠皮下接种，2w后处死裸鼠，取肿瘤组织接种于裸鼠盲肠处浆膜下，术后整体荧光成像观察肿瘤的生长、演进和转移情况。2m后当裸鼠出现明显恶病质时处死，整体荧光体视镜下解剖观察裸鼠原位成瘤及转移情况和常规病理取材。4．病理学检查取各实验组裸鼠组织标本10％中性福尔马林固定、石蜡包埋制片，HE染色，光学显微镜下观察肿瘤细胞转移情况并拍照。5．统计学处理实验数据采用SPSS13.0软件包进行统计：MTT测量生长曲线的数据采用析因分析，结肠原位接种成瘤体积大小采用独立样本T检验。结果1．SW480细胞亚株鉴定结果两组细胞均100％稳定表达绿色荧光蛋白，SW480／EGFP~+／Tiam1~-较SW480／EGFP~+细胞体积增大，纤维细胞样细胞、单极和多极细胞增多，细胞与细胞连接紧密；MTT结果显示两种细胞亚株体外增殖能力无明显差异(P＞0.05)；免疫细胞化学检测Tiam1的表达，SW480／EGFP~+细胞为强阳性，SW480／EGFP~+／Tiam1~-细胞为阴性；Western blot结果显示SW480／EGFP~+／Tiam1~-细胞的Tiam1蛋白水平较SW480／EGFP~+细胞有明显下降(下降70％左右)。2．尾静脉注射大肠癌血行转移可视化动物模型的研究2×10~5／0.2ml／只尾静脉注射，SW480／EGFP~+与SW480／EGFP~+／Tiam1~-组裸鼠均无转移；2×10~6／0.2ml／只尾静脉注射，SW480／EGFP~+组4只裸鼠转移，转移率为50％。未发现肝脏转移，且心脏、肺、骨有转移的裸鼠都是2只，转移率为25％。SW480／EGFP~+／Tiam1~-组仍无转移。3．结肠原位接种自发转移可视化动物模型的研究SW480／EGFP~+和SW480／EGFP~+／Tiam1~-瘤块在裸鼠结肠原位接种均可成活，但是SW480／EGFP~+／Tiam1~-组成瘤体积明显小于SW480／EGFP~+组(P＜0.05)。SW480／EGFP~+／Tiam1~-组只有1只腹壁浸润转移，转移率为16.6％。而SW480／EGFP~+组6只腹腔广泛种植转移，其中2只伴有肝肺和胸腔转移，转移率为75％。4．病理学检查显微镜下观察各裸鼠成瘤转移情况同整体荧光成像仪下观察结果基本一致，可视化观察到的心脏、肺、肝、骨等转移部位均可见转移的癌组织；还检测到尾静脉注射心脏转移的2只裸鼠中1只出现大量肺内微转移灶。另外，SW480／EGFP~+组原位和转移部位均可见肿瘤细胞侵犯淋巴与血管组织，而SW480／EGFP~+／Tiam1~-组未见此现象。结论1．成功建立人大肠癌尾静脉注射血行转移与原位接种自发转移动物模型，评价Tiam1基因沉默对SW480细胞成瘤与转移的影响；2．Tiam1基因沉默有效抑制大肠癌细胞系SW480的血行转移和原位移植自发转移；3．Tiam1基因促进肿瘤细胞体内成瘤与转移，可能在调控细胞形态、黏附和运动以及与血管因子间相互作用中起重要作用；4．血行转移模型证实，人大肠癌细胞株SW480尾静脉注射可发生心脏、肺、骨转移，而无肝脏转移。因此，认为大肠癌肝高转移率的发生机理除肝组织具有适应大肠癌细胞生长环境外，其解剖位置是重要因素；5．SW480／EGFP~+和SW480／EGFP~+／Tiam1~-是两种稳定可靠的人大肠癌细胞亚株，可广泛应用于大肠癌转移机制和抗大肠癌转移药物的研究。