论文部分内容阅读
目的:胃癌是常见的恶性肿瘤之一,发病率全球排列第五,仅次于肺癌,乳腺癌,结肠癌和前列腺癌,死亡率全球排列第三,仅次于肺癌和肝癌。超过70%的胃癌患者发生在发展中国家,其中以东亚国家为主,中国和日本是胃癌高发病区。胃癌的发生由胃部损伤和慢性炎症等胃部疾病进展而来。导致胃部疾病的病因主要有幽门螺旋杆菌(Helicobactor pylori,HP)感染,酒精和非甾体类抗炎药的损伤,饮食习惯不良等。其中HP的感染最受瞩目。1994年,世界卫生组织国际癌症研究机构(IARC)将HP列为Ⅰ类致癌因子,HP导致胃部慢性炎症,炎症反复发作导致胃上皮细胞原癌基因被激活,细胞逐渐发生癌变。青蒿素(Artemisinin,ART)及其衍生物作为抗疟疾的特效药受到医药界各个领域的关注,因而其药效也得到了广泛的扩展。研究发现,ART及其衍生物能导致乳腺癌、宫颈癌、肝癌、胃癌、结直肠癌等多种癌细胞发生凋亡。除此之外,其在微生物领域也得到广泛的研究,ART对炭蛆杆菌、表皮葡萄球菌、卡他球菌等有较强的抑制作用,对结核杆菌、绿脓杆菌和金黄色葡萄球菌等也有一定的抑制作用。尽管ART及其衍生物对胃癌的防治作用已经得到了深入的研究,但是其对HP相关胃癌的作用尚未被报道。因此,我们开展了一系列的实验来阐述ART及其衍生物双氢青蒿素(Dihydroartemisninin,DHA)和青嵩琥酯(Artesunate,ARTS)对 HP 导致的胃癌的化学预防作用,并将从抗炎的角度考察其作用机理。方法:1.ART,DHA和ARTS对HP和胃癌上皮细胞的体外抑制作用采用微量二倍稀释法检测ART(浓度为0,5,10,20,40,80 μM),DHA(浓度为 0,1.25,2.5,5,10,20 μM),ARTS(浓度为 0,1.25,2.5,5,10,20 μM)作用24 h后对HP菌株ATCC 43504的体外抑制作用;采用MTT的方法检测ART(浓度为 0,12.5,25,50,100,200 μM),DHA(浓度为 0,6.25,12.5,25,50,100 μM),ARTS(浓度为 0,6.25,12.5,25,50,100μM)作用 24h后对胃癌上皮细胞 SGC-7901的体外抑制作用。2.ART,DHA和ARTS对HP诱导的炎症反应和氧化反应的抑制作用三种药物预处理SGC-7901细胞24 h后,用HP诱导细胞24 h(MOI = 100),采用Western Blotting和ELISA的方法考察三种药物(浓度均为0,5,10,20 μM)对HP诱导胃上皮细胞NF-κB通路中蛋白以及下游炎症因子的表达影响。三种药物预处理SGC-7901细胞24h后,用HP诱导细胞6h(MOI = 100),采用流式细胞术的方法考察三种药物(浓度均为0,5,10,2μM)对HP导致的胃癌上皮细胞中ROS升高的影响,采用Western Blotting来考察三种药物对HO-1和NQO1抗氧化蛋白的作用。3.ART,DHA和ARTS对胃癌上皮细胞裸鼠移植瘤的生长抑制作用采用200万SGC-7901细胞系接种BALB/c/nu/nu小鼠左腋皮下,建立胃腺癌移植瘤模型,考察三种药物在给药浓度均为25 mg/kg和50 mg/kg,给药24 d后对裸鼠体内胃癌细胞的生长抑制作用;4.ART,DHA和ARTS对HP联合甲基亚硝基脲(Methylnitrosourea,MNU)诱导的胃癌的预防作用采用HP联合MNU诱导胃癌模型来考察ART(60 mg/kg),DHA(60 mg/kg)和ARTS(60 mg/kg)对胃癌发生和发展的预防作用。采用HE染色方法检测小鼠胃部的组织学性质;采用免疫组织化学的方法检测小鼠胃组织中IκB-α,p-IκB-α,COX2的表达情况;采用ELISA的方法检测小鼠血清中IL-1β,IL-6和TNF-α的表达水平。5.统计学分析采用SPSS 13.0统计软件进行数据分析;采用GraphPad 5.0数据分析软件,数据结果以Mean ± SD表示;多组间均数比较采用One way-ANOVA,p<0.05表示具有显著学差异。结果:1.ART,DHA和ARTS对HP和胃癌上皮细胞的体外抑制作用MTT实验结果说明,三种药物对HP生长的抑制强度为DHA>ARTS>ART,其中DHA和ARTS在20 μM的时候几乎能完全抑制菌株的生长;三种药物分别作用于正常的胃上皮细胞GES-1和胃癌上皮细胞SGC-7901 24h后,发现药物对肿瘤细胞的生长抑制作用比正常细胞更明显;2.ART,DHA和ARTS对HP诱导的炎症反应和氧化反应的抑制作用HP感染胃癌上皮细胞SGC-7901后,能够激活NF-κB通路,使IκB-α的表达量降低,使其对p65的抑制作用减弱,从而使p65能更好的发挥其转录因子的作用,诱导下游炎症因子表达,研究结果表明ART,DHA和ARTS都能逆转这一过程;HP感染胃癌上皮细胞SGC-7901后,能够显著的诱导ROS的生成,ART,DHA和ARTS都能浓度依赖降低ROS的生成;3.ART,DHA和ARTS对胃癌上皮细胞裸鼠移植瘤的生长抑制作用25 mg/kg和50mg/kg ART对裸鼠胃癌细胞移植瘤的抑制率分别为29.9%和33.9%,DHA为19.5%和45.4%,ARTS为30.9%和40.7%,阳性药物环磷酰胺在25 mg/kg时对体内胃癌细胞生长的抑制率为53.5%;4.ART,DHA和ARTS对HP联合MNU诱导的胃癌的预防作用HP联合MNU诱导的胃癌模型中,模型组的成癌率为78.6%,ART给药组的成癌率为73.3%,DHA给药组的成癌率为43.8%,ARTS组的成癌率为60%;免疫组织化学结果显示,在该胃癌诱导模型上,ART,DHA和ARTS均能有效的降低COX-2的蛋白表达水平,升高IκB-α蛋白水平;血清ELISA实验结果显示,在该模型中,ART,DHA和ARTS均能显著地降低炎症因子IL-1β,IL-6和TNF-α的蛋白表达水平。结论:ART,DHA和ARTS都能够抑制HP的生长,其中DHA的作用最明显;ART,DHA和ARTS能抑制体内外肿瘤细胞的生长;在HP感染的胃癌细胞模型中,ART,DHA和ARTS能够通过减少炎症因子的产生而抑制炎症反应;在HP联合MNU诱导的胃癌模型中,ART,DHA和ARTS都能有效的预防肿瘤的发生,其中DHA的作用最明显。