功能化离子液体化学修饰脂肪酶的催化性能强化研究

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脂肪酶(E.C.3.1.1.3)是工业生产中常见的一种水解酶,由于其催化的反应具有一系列的优点,因而在食品、纺织、化工、医药、洗涤剂及能源等工业领域广泛应用。目前工业生产一般需在高温、高压等环境条件下进行,在此极端条件下脂肪酶极易失活,因此对其进行分子改造以强化其催化性能,为工业应用提供活性更高、选择性更专一、稳定性更好、环境耐受性更强的新酶品种,具有重要的实际应用价值。本论文以猪胰脂肪酶(PPL)及南极假丝酵母脂肪酶(CALB)为研究对象,尝试不同的功能化离子液体对PPL及CALB进行化学修饰,以期获得高稳定性、高活性的脂肪酶,从而发展一种新颖、高效的酶修饰方法。本研究主要内容包括:  ⑴将含有不同阴阳离子的咪唑类功能化离子液体共价接枝到CALB的赖氨酸上,CALB的9个赖氨酸有4-6个被修饰。使用对硝基苯酚棕榈酸酯水解反应来考察酶的活力及稳定性。修饰之后的CALB在水相中有较高的催化效率,[HOOCMMIm][Cl]修饰的酶提升了1.5倍的催化效率。修饰后的热稳定性及有机溶剂耐受性也获得了大幅的提升,[HOOCBMIm][Cl]含有K型阳离子及C型阴离子修饰的酶在70℃下的热稳定性提高了7倍,在50%的DMF中的耐受性提高了1倍,在50%的甲醇中的耐受性提高了5倍。酶修饰前后的构象变化通过荧光光谱、圆二色谱及红外光谱来确证。  ⑵采用了含不同链长不同阴离子的咪唑类、胆碱类的功能化离子液体化学修饰PPL,修饰之后催化性能有了明显的提升。通过对硝基苯酚棕榈酸酯的水解,考察修饰前后PPL的水解活力、热稳定性、动力学参数等酶学性质。以(R,S)-1-醋酸苯乙酯的水解拆分考察修饰前后酶的对映体选择性等酶学性质。通过光谱学数据研究催化性能与修饰的关联。当离子液体含有C型的阳离子与K型的阴离子结构的时候,修饰的酶拥有显著的水解活力,[choline][H2PO4]修饰的PPL获得了4倍的水解活力的提升。而当离子液体结构中含有K型的阳离子以及C型的阴离子的时候,更能有助于提升酶的热稳定性以及立体选择性,[HOOCBMIm][Cl]修饰的PPL在60℃下的热稳定性相较于游离酶提高了12倍,立体选择性提高了7倍。使用质谱法确定了酶的修饰,结合荧光光谱与圆二色谱解析了功能性离子液体化学修饰PPL的活力及稳定性强化的机制。  ⑶以PPL为模型酶,采用多种功能化离子液体化学修饰PPL,旨在强化酶在水溶性离子液体中的催化性能。使用对硝基苯酚棕榈酸酯的水解对修饰前后的酶分别考察在不同离子液体浓度中的催化活力,在一定浓度的离子液体中的热稳定性,动力学常数。PPL经过修饰之后在水溶性1,3-二甲基咪唑硫酸甲酯盐([MMIm][MeSO4])中活力增大,在0.4 M[MMIm][MeSO4]的体系中仍保持活力的不丢失,而此时的游离酶有18%的活力损失。[HOOCBMIm][Cl]修饰的PPL在0.3 M[MMIm][MeSO4]的体系中活力提升了2倍。所有的修饰酶都表现出了显著的热稳定性提升,其中[HOOCBMIm][Cl]修饰的PPL在60℃下0.24 M[MMIm][MeSO4]的体系中的热稳定性相较于游离酶提高了6倍。使用荧光光谱与圆二色谱解析了功能性离子液体化学修饰PPL在水溶性[MMIm][MeSO4]中的活力及稳定性强化的机制。
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