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第一部分:重组大鼠4-1BBL基因真核表达载体的构建及功能鉴定目的探讨大鼠4-1BBL对树突状细胞(DCs)表面分子及免疫功能的影响。方法构建真核表达质粒pIRES2-EGFP-4-1BBL并利用脂质体介导转染HepG2细胞,G418筛选出阳性克隆,RT-PCR和荧光显微镜分别检测4-1BBL基因转录和绿荧光蛋白(GFP)的表达;流式细胞术(FCM)检测不同HepG2细胞与DCs共培养2d后表面CD80及MHC-Ⅱ的表达,ELISA测定共培养上清中IL-6和IL-12的含量。结果成功构建pIRES2-EGFP-4-1BBL重组表达载体并在HepG2细胞中获得稳定表达,重组大鼠4-1BBL能促进骨髓来源DCs表面MHC-Ⅱ、CD80分子表达和IL-6、IL-12分泌(P＜0.05)。结论重组大鼠4-1BBL具有促进DCs成熟的功能。第二部分:含pIRES2-EGFP-4-1BBL质粒减毒沙门氏菌的构建及功能鉴定目的构建含pIRES2-EGFP-4-1BBL质粒的减毒沙门氏菌(SL3261)疫苗菌。方法将质粒pIRES2-EGFP-4-1BBL转入鼠伤寒沙门氏菌(LB5000)进行甲基化,利用修饰后重组质粒转化终宿主菌SL3261,抗生素筛选后挑取单个菌落扩增进行抽提质粒和PCR鉴定,SL3261疫苗菌与HepG2细胞体外共培养,荧光显微镜和RT-PCR分别检测绿荧光蛋白(GFP)的表达和4-1BBL基因的转录。结果导入pIRES2-EGFP-4-1BBL质粒的SL3261经抽提质粒电泳后获得了同原转化质粒相同大小的目的条带,质粒PCR获得了约930bp的条带,200个HepG2细胞感染SL3261为201±46 CFU、SL3261-pIRES2-EGFP为163±37 CFU,而SL3261-pIRES2-EGFP-4-1BBL为158±32 CFU,含质粒SL3261在体外感染HepG2细胞的能力同原细菌基本相同。感染含质粒SL3261的HepG2细胞观察到GFP表达,感染含重组质粒SL3261的HepG2细胞经RT-PCR检测到约930bp的目的条带。结论成功构建了能携带大鼠4-1BBL基因真核表达质粒的SL3261疫苗菌。第三部分:含pIRES2-EGFP-4-1BBL质粒减毒沙门氏菌对大鼠免疫功能的影响目的利用减毒沙门氏菌为载体将4-1BBL体内转染抗原提呈细胞(APCs),观察体内4-1BBL基因转染对大鼠免疫功能的影响。方法疫苗菌(SL3261+recombinedplasmid)2周内连续灌服大鼠3次,设立含质粒细菌(SL3261+plasmid)、细菌SL3261和PBS对照,末次灌服后14d心脏取血处死,RT-PCR检测报告基因GFP在脾脏细胞中的转录,荧光显微镜直接观察和流式细胞仪检测报告蛋白GFP在脾脏细胞中的表达,免疫双荧光染色检测脾脏组织中4-1BBL蛋白的表达,流式细胞仪对外周血和脾脏中细胞表型检测,ELISA法检测PHA刺激脾细胞72小时后培养上清中IFN-γ的含量。结果疫苗菌同原细菌具有相同的侵袭能力并能成功的将外源基因携带至外周血和脾脏组织中转录表达,灌服疫苗菌的大鼠外周血和脾脏细胞4-1BBL和4-1BB表达明显升高,外周血中CD3~+、CD3~+CD8~+和CD3~+CD25~+,脾脏细胞中CD3~+CD8~+、CD3~+CD25~+也有明显增高(P＜0.05)。脾细胞经PHA刺激后分泌IFN-γ的能力也明显增强(P＜0.05)。结论含4-1BBL基因的减毒沙门氏疫苗菌能实验体内抗原提呈细胞的基因转染,4-1BBL的表达增强能明显增强机体的细胞免疫功能。第四部分:实验性大鼠大肠癌时机体免疫功能的改变目的模拟人类大肠癌的形成,建立一种大肠癌的模型并探讨实验性大肠癌时机体免疫功能变化。方法利用1,2-二甲肼诱导S-D大鼠建立大肠癌模型,流式细胞术(FCM)检测成瘤16周、21周时外周血和21周时脾脏中CD3、CD4、CD8、CD25、4-1BB和4-1BBL表达率,ELISA法检测成瘤21周时脾细胞经PHA刺激后分泌IFN-γ的能力。结果21周时处死大鼠并对大鼠的肠道进行解剖,结果表明利用该方法的诱癌率达100%(5/5),16周时成瘤组外周血CD3~+和CD3~+CD4~+较对照组表达率略有降低,但两者无统计学差异(P＞0.05);21周时成瘤组外周血和脾脏中CD3~+CD4~+较对照组表达率明显降低(P＜0.05),外周血和脾脏中成瘤组4-1BB和4-1BBL的表达较对照组均表达降低,但无统计学差异;成瘤组脾细胞PHA刺激试验后分泌IFN-γ的能力较对照组有显著的下降(P＜0.01)。结论利用1,2-二甲肼成功建立了S-D大鼠的大肠癌模型,证明了实验性大鼠大肠癌时同人类大肠癌具有类似的免疫功能降低,主要是细胞免疫功能的下降。第五部分含pIRES2-EGFP-4-1BBL质粒减毒沙门氏菌对大鼠大肠癌生长的影响目的探讨减毒沙门氏菌为载体的4-1BBL基因疫苗菌对荷瘤大鼠免疫系统的影响以及治疗大肠癌可行性。方法利用1,2-二甲肼连续20周皮下注射建立大鼠大肠癌模型,在14周按分组(每组5只)分别灌服2ml PBS和2ml浓度为10~9/ml的SL3261、SL3261+plasmid和SL3261+recombined plasmid,荷瘤大鼠按上述方法分别在第16周和第18周再根据分组灌服二次加强免疫,于16周右心房抽血检测外周血细胞表型,21周处死全部大鼠,解剖并观察成瘤数量、大小、是否转移并进行Dukes分期评判;流式细胞仪检测外周血和和脾脏中细胞表型并利用PHA刺激脾细胞分泌IFN-γ水平,对大肠、肝、肺、腹腔等原发和转移部位以及功能可能影响的部位HE染色镜检,对结肠、脾脏和肝脏冰冻切片免疫双荧光法检测4-1BBL和报告基因GFP表达。结果SL3261+recombined plasmid组平均成瘤数为9.4±4.3个,明显低于PBS组的18.2±4.7个、SL3261组的12.8±4.5和SL3261+plasmid组的12.2±4.4(P＜0.05),SL3261组和SL3261+plasmid组的成瘤数略低于PBS组,但相比无明显统计学意义(P＞0.05);灌服疫苗菌的荷瘤大鼠在结肠、脾脏和肝脏中有报告蛋白GFP和较多的4-1BBL蛋白表达。外周血和脾脏细胞表型检测显示活化T细胞CD3~+CD25~+较其它荷瘤组明显增高(P＜0.05),脾细胞PHA刺激试验后分泌IFN-γ的能力也明显增强(P＜0.05)。结论含重组质粒pIRES2-EGFP-4-1BBL的减毒沙门氏菌可以实现荷瘤大鼠体内4-1BBL基因转染,体内高表达4-1BBL可提高荷瘤大鼠的细胞免疫功能从而抑制实验性大鼠大肠癌的生长。