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本论文借助一系列的实验动物学,免疫学,病理学,生物化学和分子生物学等方法成功建立斑马鱼-ISKNV感染模型,并通过差减文库的方法找到一系列的免疫,病理相关基因,为揭示低等生物抗病毒免疫机制的研究奠定基础和提供必要的平台。同时作为低等生物的代表,本论文还就斑马鱼中LPS耐受问题及LPS识别分子TLR4功能进行了初步验证。
1,本论文成功的建立斑马鱼-传染性脾脏肾脏坏死病病毒(infectious spleenand kidney necrosis virus,ISKNV)感染模型,并进行一系列的鉴定工作。发现斑马鱼感染ISKNV后出现以全身性出血,竖鳞及脾脏肿大为特征的典型的临床症状,病理组织学检查发现明显的贫血症状。免疫组织化学及免疫荧光分析发现病毒能够感染斑马鱼多个组织器官,但病毒信号并不位于组织特异性细胞,提示病毒宿主细胞可能为问质细胞。同时比较发现感染斑马鱼自身不同组织内病毒表现有所不同,具体为病毒感染能力的相似性及病毒增殖能力的差异,与感染鳜鱼比较发现感染斑马鱼中病毒没有表现任何形式的细胞外释放,而在感染鳜鱼中则完全相反病毒大部分已释放到感染细胞外,病毒在斑马鱼传代过程中,这种释放抑制的情况有所改观;流式细胞及real—time RT-PCR检测显示斑马鱼淋巴细胞有所增加,经典的免疫相关分子几乎没有任何变化,提示斑马鱼可能采取不同的策略清除病毒。
2,成功建立斑马鱼不同病毒来源,不同组织,不同感染时间的5个差减cDNA文库,排查出大量免疫相关,病理相关的基因,揭示病毒感染后斑马鱼免疫学,病理学的变化,推测其可能采取的免疫学机制。具体基因主要分三个部分,一是免疫相关基因,二是凋亡相关基因,三是肿瘤相关基因,发现斑马鱼-ISKNV中可能通过NF-?B活性抑制从而抑制经典抗病毒分子的表达,在斑马鱼-ISKNV中发现大量持续表达的急性期反应蛋白和凝集素分子,同时也发现体液免疫分子lg及细胞免疫效应分子穿孔素的上调,免疫信号通路分子MAPK及ERK分子;凋亡相关基因相关基因主要为细胞色素C氧化酶,easpase a及caspase 8等并通过实验方法验证在斑马鱼感染ISKNV后大量凋亡现象的出现。肿瘤相关基因主要为Ras原癌基因家族,可能参与Ras-MAPK-ERK.通路激活。
3,对低等生物LPS不敏感问题进行初步探讨,发现斑马鱼面对高剂量LPS刺激同样表现为耐受,斑马鱼LPS受体分子TLR4主要在血液中表达,并且LPS能够引起其上调表达,同时还发现斑马鱼TLR4a,TLR4b不同细菌来源LPS的反应性有所不同,与其他生物TLR4基因进化分析发现呈现一种以TIR—domain为单位的一种趋同进化模式。
4,LPS胚胎注射发现能够引起斑马鱼发育畸形,NTL真核表达质粒共注射发现可进行表型挽救,同时发现TLR4分子的下调表达,TLR4真核表达质粒共注射发现增加LPS对胚胎的致死性,说明斑马鱼胚胎可能通过TLR4的下调来抵御LPS对胚胎的毒性作用。