论文部分内容阅读
Toll-like 受体识别病原相关的分子模式，主要在调控天然免疫中发挥作用。在肝脏中Toll-like受体激活炎症信号通路如NF-κB，JNK，p38和干扰素信号通路，并且起着调控抗病毒、抗细菌应答，病毒感染和伤口愈合的作用。
本文主要针对Toll-like信号途径相关蛋白筛选人类肝脏cDNA文库所得到的新的蛋白质相互作用进行进一步的验证。这三对待验证的相互作用对为：IRF3和SGTA，LBP和PRDX4，Pellino2和THAP7。
工作主要包括以下内容：
(1) 以pCDNA3.1-HisA为骨架载体，构建载体Myc-gfp和Flag-man。将编码IRF3，LBP，Pellino2的基因分别克隆到载体Myc-gfp上，并将编码SGTA，PRDX4，THAP7的基因克隆到载体Flag-man。
(2) 合成超折叠绿色荧光蛋白基因，改造载体pEGFP-C1，用超折叠绿色荧光蛋白基因替换 pEGFP-C1 上的绿色荧光蛋白基因，完成定位载体pSFGFP-C1 的改造。并将编码IRF3的基因克隆到载体pSFGFP-C1上，将编码SGTA的基因克隆到载体pDsRed-C1。
(3) 将编码IRF3，LBP，Pellino2的基因分别克隆到载体pGEX上，将编码SGTA，PRDX4，THAP7 的基因克隆到载体pET28a上。重组质粒pGEX-IRF3和pGEX-Pellino2转化XL10-Gold，重组质粒pET28a-SGTA，pET28a-THAP7转化BL21(DE3)，分别接种单菌落培养，并在诱导表达后进行纯化。这四种蛋白能有效地进行表达和纯化。
(4) 表达质粒Myc-IRF3，Myc-Pellino2，Myc-LBP；Flag-SGTA，Flag-THAP7，Flag-PRDX4分别转染HEK293细胞，并通过免疫印记检测6种蛋白的表达。免疫印记结果显示这六种蛋白都能在HEK293细胞中表达。
(5) 通过免疫共沉淀验证IRF3和SGTA，LBP和PRDX4，Pellino2和THAP7的之间的互作，结果显示这三对蛋白都能互作。
(6) GST-pulldown验证IRF3和SGTA，Pellino2和THAP7的互作。
(7) 利用免疫荧光检测LBP和PRDX4，Pellino2和THAP7在细胞中的定位，并将质粒pSFGFP-IRF3，pDsRed-SGTA共转染Hela细胞验证在细胞中的定位。结果显示PRDX4，Pellino2，THAP7，IRF3，SGTA都定位于细胞质中，而LBP定位于细胞质或细胞膜上。