新生儿缺氧缺血性脑损伤(hypoxic-ischemic brain damage, HIBD)是新生儿期常见的疾病,是指由各种原因,主要指围生期窒息,引起的脑组织部分或完全缺氧、脑血流减少或暂停而造成的神经细胞的大量凋亡、坏死,脑水肿,脑室周围白质囊泡化,继发脑组织重建,导致大脑结构及功能受损,造成相应的神经功能障碍,并且出现严重的后遗症,是引起新生儿急性死亡和慢性神经系统损伤,新生儿后期神经系统伤残(智力低下、癫痫、脑瘫)的主要原因之一。近年来,随着新生儿抢救技术的日益提高,脑损伤的发病率不但未降,反而有升高趋势。目前的治疗方法旨在缓解症状和控制更进一步的脑损伤,疗效欠佳。神经干细胞(neural stem cells, NSCs)以其自我更新、持续分裂增殖能力及多潜能分化的特点,替代受损的神经细胞,整合入宿主组织的神经环路,抑制神经细胞的凋亡,促进神经功能的修复,成为治疗神经系统疾病的理想种子细胞。在神经干细胞来源方面,与神经系统细胞移植治疗中其它细胞来源相比,脐血干细胞以其来源丰富,抗原性弱,移植物抗宿主病发生率低、反应轻,不涉及社会伦理道德及法律等优势成为神经干细胞的新来源。因此使用脐血干细胞定向诱导分化为NSCs用于临床研究有广阔的应用前景；同时神经干细胞是基因转染的良好载体,利用基因转染技术,将目的基因通过载体(如脂质体、病毒、多种阳离子物质及磷酸钙等)转染入神经干细胞,待检测出其稳定表达后,再将含有目的基因的神经干细胞进行移植。基因修饰的神经干细胞不但可以起到细胞替代的作用,而且目的基因分泌的营养因子可以改善脑损伤局部的内环境促进轴索的再生。胰岛素样生长因子1 (Insulin like Growth Factor-1,IGF-1)在中枢神经系统发育和成熟的全过程中发挥着重要作用,是促进大脑发育所必需的神经营养和神经保护因子。最近的研究发现,IGF-1对一些中枢神经系统损伤性、退行性及神经毒性等疾病具有明显的治疗作用,可以保护神经细胞,抑制神经细胞的调亡减轻伤后功能丧失,促进伤后功能重建。既往的研究显示单用IGF-1因子或单独移植NSCs均能对动物HIBD模型发挥重要的治疗作用,本课题采用NSCs移植和IGF-1联合,即将IGF-1基因转染NSCs,通过移植基因工程化的神经干细胞(NSCs-IGF-1),探讨对HIBD的治疗作用。目的(1)本实验研究脐血源性NSCs体外分离、培养及诱导分化的方法,观察细胞增殖分化情况。(2)构建人IGF-1基因质粒表达载体pcDNA3.1-IGF-1,转染到脐血源性NSCs内,构建基因工程化的神经干细胞(NSCs-IGF-1)。(3)将NSCs-IGF-1移植新生大鼠HIBD模型中,观察神经干细胞在宿主脑内的存活及迁移分布情况,并对脑损伤大鼠神经功能恢复的情况进行研究,为临床上应用基因转染NSCs移植治疗HIBD提供实验依据及理论基础。方法(1)采用密度梯度离心法从人脐血中分离出单个核细胞,用hEGF、bFGF和B27因子定向诱导其向神经干细胞方向分化,观察培养过程中脐血单个核细胞增殖分化的特点,免疫细胞化学法检测神经细胞特异性标志物Nestin、NSE、GFAP的表达情况；BrdU试剂标记培养细胞,并测定BrdU阳性细胞表达率。(2)通过反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)的方法从人胎肝中提取IGF-1基因,胶回收的方法分别纯化PCR产物(IGF-1基因)和质粒pcDNA3.1,二者分别由DNA限制性内切酶BamHⅠ与HindⅢ双酶切后,经T4 DNA Ligase连接的方法将IGF-1基因克隆到质粒表达载体pcDNA3.1中,采用测序方法及DNA限制性内切酶BamHⅠ与HindⅢ双酶切方法鉴定重组质粒。(3)脂质体转染法将重组体pcDNA3.1-IGF-1及空质粒pcDNA3.1分别转染至脐血源性神经干细胞内,经G418抗性筛选后,利用免疫细胞化学法和RT-PCR法检测IGF-1基因在基因转染脐血源性神经干细胞内的表达情况。(4)7日龄75只新生SD大鼠通过结扎左侧颈总动脉,及缺氧处理的方法制备HIBD动物模型。75只HIBD大鼠被随机分成NSCs移植组、模型对照组、NSCs-IGF-1移植组,每组25只,再进一步随机分为1d、7d、14d、21d组及神经功能检测组,每组5只。移植前3天,将NSCs移植组及NSCs-IGF-1移植组细胞行BrdU标记(终浓度1μmol/L)。造模后24小时,调整细胞浓度(1×106/L),采用尾静脉注射法进行干细胞移植。25只不进行造模,且不移植任何细胞的正常SD大鼠为正常对照组。造模后的SD大鼠行NSCs-IGF-1移植的为NSCs-IGF-1移植组,造模后的SD大鼠在相同部位行NSCs移植的为NSCs组,造模后的SD大鼠行等量生理盐水注射对照的为模型对照组。(5)每组随机抽取5只动物,在移植后1d、7d、14d、21d处死,免疫荧光技术检测BrdU的表达,对移植细胞在宿主脑内的存活及迁移进行检测。Y-迷宫试验检测脑损伤大鼠神经系统学习功能及记忆功能的恢复情况。结果(1)脐血单个核细胞体外经过分离,直接加入hEGF、bFGF和B27因子进行诱导分化,可得到NSCs克隆团,并表达神经细胞特异性标记Nestin、NSE及GFAP。P3代NSCs经BrdU标记,阳性率达90%。(2)IGF-1基因从人胎肝中成功提取。重组体pcDNA3.1-IGF-1经基因序列测定及DNA限制性内切酶BamHⅠ与HindⅢ双酶切证实质粒表达载体pcDNA3.1-IGF-1构建正确。重组体经脂质体法转染脐血源性NSCs 24小时后,经G418筛选10-14天得到细胞抗性克隆,免疫细胞化学法检测到IGF-1基因在重组质粒表达载体pcDNA3.1-IGF-1转染的脐血源性NSCs中成功表达。RT-PCR方法检测到重组质粒pcDNA3.1-IGF-1转染的脐血源性NSCs中IGF-1mRNA表达阳性,而空质粒pcDNA3.1转染的脐血源性NSCs中IGF-1mRNA表达阴性。(3)BrdU对NSCs移植HIBD动物模型示踪显示,BrdU阳性细胞在NSCs-IGF-1组及NSCs组均可见。由静脉途径移植的BrdU阳性细胞能迁移到HIBD大鼠脑内,随着时间的推移趋化至损伤侧室管膜下区存活。移植第7d后,与NSCs移植组相比较,NSCs-IGF-1移植组BrdU阳性率明显增高,差异有统计学意义(P<0.05)。(4)IGF-1基因转染的神经干细胞(NSCs-IGF-1)移植可以更好改善脑损伤大鼠学习及记忆功能。结论(1)脐血单个核细胞体外可定向诱导分化为神经干细胞,脐血可成为神经干细胞的一种新来源。(2)IGF-1基因可在重组质粒表达载体pcDNA3.1-IGF-1转染的脐血源性神经干细胞内成功表达。(3)IGF-1基因转染的NSCs具有更强的分裂增殖能力。(4)NSCs-IGF-1和单纯NSCs分别移植HIBD新生大鼠后,干细胞均能在宿主脑组织内存活、迁移。(5)IGF-1基因转染的NSCs可更加明显促进脑损伤大鼠神经系统功能的恢复。(6)由IGF-1基因构建的基因工程神经干细胞移植治疗HIBD新生大鼠是一种有效的治疗方法。