目的:Wnt/β-catenin信号传导通路异常与大多数肿瘤的发生发展有关,但Wnt/β-catenin信号传导通路在抗肿瘤化疗药物抵抗方面的作用机制仍不清楚。通过研究Beclin 1基因过表达在MG63骨肉瘤细胞自噬以及MG63骨肉瘤细胞对Gemcitabine的抵抗中的作用,和Wnt/β-catenin信号传导通路在MG63骨肉瘤细胞自噬中的作用,探讨Wnt/β-catenin信号传导通路与Beclin 1基因过表达MG63骨肉瘤细胞对Gemcitabine的抵抗之间的关系。方法:1.MG63骨肉瘤细胞培养用DMEM培养液加上10%灭活的胎牛血清,在含有5%CO2的37℃培养箱中培养MG63骨肉瘤细胞,待细胞约90%融合时,在生物安全柜中进行细胞传代。加入少许0.125%胰蛋白酶和0.02%EDTA,消化3-5分钟,倒置显微镜下观察到胞质回缩、细胞间隙增大时,完全培养基终止消化,离心去上清(1000 rpm),按1:3比例进行细胞传代。2.共焦荧光显微镜监测自噬将Ds Red-LC3-GFP连接到逆转录病毒载体上,与辅助质粒Gag-pol和VSVG一起共转染293T细胞,收集病毒上清后感染靶细胞。经Puromycin筛选后,建立稳定表达Ds Red-LC3-GFP的细胞株。用无血清培养基培养293T细胞3天做为阳性对照组观察自噬的发生。在共焦荧光显微镜下观察靶细胞荧光表达情况,没有发生自噬时,Ds RED红光和GFP绿光都有表达,发生自噬时,主要表现为Ds RED红光为主。3.Western blot检测在细胞蛋白抽提开始前加入0.1mol/L PMSF,1×106细胞用PBS洗两次,用含有0.1mol/L PMSF的裂解液孵育。细胞裂解物13000rpm,4℃离心20min。梯度稀释BSA标准品,配制浓度为20-2000μg/m L的待测样品。配制BCA溶液,显色反应30min,562nm测定标准液和样品的吸光度,平行测三次,计算待测样品浓度。根据待检测蛋白的分子量,配制10%的分离胶,浓缩胶浓度为4%。取待检测蛋白样品20μL上样,进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,转0.45μm孔径NC膜1小时,将膜完全浸没在5%脱脂奶粉-TBST中室温轻摇1小时,一抗(anti-Beclin 1和anti-LC3B)室温孵育10min,放4℃过夜,第二天取膜,在室温孵育30min,TBST洗膜5次,3min/次,用HRP标记的山羊抗兔Ig G(H+L),室温下轻摇40min,TBST洗膜6次,3min/次。配制ECL溶液,将其滴加到膜上,室温下避光反应3-5min,选择不等时间多次胶片曝光,显影1-2min,定影。4.PCR检测Caspase 3、Caspase 7、BCL-2、cyclin D1、c-FLIP的表达取贴壁培养的呈对数生长的MG63骨肉瘤细胞约0.5×106个,培养12小时后分别给予Gem(10μg/m L)、Gem(50μg/m L)、Beclin 1+Gem(10μg/m L)、Beclin 1+Gem(50μg/m L)处理,并设立空白对照组。培养24小时后,用0.125%的胰蛋白酶消化后,PBS洗涤2次,用TRIZOL试剂提取细胞总RNA,根据操作说明合成c DNA。根据Promega公司的M-MLV操作说明书进行总RNA逆转录。5.PCR检测ATG4、Beclin 1、LAMP1、ATG5、ATG12的表达选取对数生长期的MG63骨肉瘤细胞约0.5×106个,培养12小时后分别给予Wnt3a(200ng/m L)、XAV939(1μmol/L)处理,设对照组。依次进行细胞总RNA的提取、c DNA的合成、总RNA逆转录以及检测基因引物探针的设计(方法同4)。6.流式细胞仪检测将MG63骨肉瘤细胞以1×106接种于6孔板,培养72小时后进行消化,使细胞形成单细胞悬液,2000rpm离心5min,弃去上清,用预冷的PBS洗涤2次。用100μL结合缓冲液重悬细胞,加入5μL Annexin-V染色液和5μL PI染色液,室温下避光孵育20分钟,以流式细胞仪检测细胞凋亡。7.ELISA技术分析beclin 1在MG63骨肉瘤细胞上清的水平取10μL细胞上清液用0.05mol/L Na HCO3稀释到100μL包被ELISA板,室温下振荡1.5小时。PBST洗板3次,加封闭液(PBST加1%脱脂奶粉)350μL/孔,室温下放置1小时,PBST洗3次。加封闭液稀释的胃蛋白酶原一抗100μL/孔,ELISA板于室温振荡1小时,PBST洗3次。加封闭液稀释的HRP标记的羊抗鼠二抗100μL/孔,ELISA板于室温振荡1小时,PBST洗3次。加入OPD显色液100μL/孔,避光反应约10-30分钟。1mol/L H2SO4 100μL/孔终止反应,酶标仪测OD450nm。实验结果以均数±标准差表示,组间整体比较采用单因素/双因素方差分析,进一步采用LSD法进行两两比较检验。所有分析均在SPSS16.0软件中完成,以p<0.05表示差异有统计学意义。结果:1.过表达Beclin 1基因可诱发MG63骨肉瘤细胞自噬的发生过表达Beclin 1基因的MG63骨肉瘤细胞蛋白条带明显,而对照组细胞未见明显蛋白条带,差异有显著的统计学意义(p<0.05),表明在MG63骨肉瘤细胞中成功的过表达了Beclin 1基因。过表达Beclin 1基因的MG63骨肉瘤细胞其LC3B-Ⅱ蛋白条带较对照组明显,差异有显著的统计学意义(p<0.01),表明LC3B发生剪切,即自噬增加。2.Beclin 1过表达后可减少Gemcitabine诱导的MG63骨肉瘤细胞凋亡Gemcitabine可诱导凋亡相关基因(Caspase 3、Caspase 7)的表达,下调抗凋亡基因(BCL-2,cyclin D1和c-FLIP)的表达,且呈剂量依赖性。Beclin 1基因过表达后会逆转上述过程,减少凋亡相关基因的表达。3.激活Wnt信号通路可降低MG63骨肉瘤细胞自噬,抑制可促进自噬激活Wnt信号通路可降低自噬,抑制Wnt信号通路可促进自噬。抑制Wnt/β-catenin信号通路可显著增加Beclin 1基因的表达,表明Beclin 1基因的表达可能在Wnt/β-catenin信号通路抑制自噬方面起一定的作用。4.激活Wnt信号通路可降低自噬,减少Beclin 1基因过表达MG63骨肉瘤细胞对Gemcitabine的抵抗Gemcitabine可以诱导MG63骨肉瘤细胞凋亡,Beclin 1基因过表达MG63骨肉瘤细胞可减少Gemcitabine诱导的凋亡,激活Wnt信号通路可降低自噬,增加Beclin1基因过表达MG63骨肉瘤细胞凋亡,从而减少Beclin 1基因过表达骨肉瘤细胞对Gemcitabine的抵抗。应用Gemcitabine处理的Beclin 1基因过表达MG63骨肉瘤细胞存活率呈剂量依赖性下降,在应用Gem(40μg/m L)和Gem(60μg/m L)处理的Beclin 1基因过表达MG63骨肉瘤细胞中加用Wnt3a(200ng/m L)可明显降低细胞存活率,差异有显著的统计学意义(p<0.01),而加用XAV939(1μmol/L)可明显提升细胞存活率,差异有显著的统计学意义(p<0.01)。实验结果表明,Wnt信号传导通路通过下调Beclin 1基因的表达抑制MG63骨肉瘤细胞的自噬,降低Gemcitabine诱导的MG63骨肉瘤细胞凋亡。结论:Beclin 1基因过表达可诱发MG63骨肉瘤细胞自噬的发生,并减少Gemcitabine诱导的MG63骨肉瘤细胞凋亡。Beclin 1过表达后可减少Gemcitabine诱导的凋亡,但Wnt信号通路激活可反向抑制。我们的研究结果为解决抗肿瘤化疗药物耐药性的问题提供了一个新的见解。Wnt/β-catenin信号通路异常可以促进Beclin1介导自噬,从而阻止化疗药物诱导的细胞凋亡。我们的研究结果为通过调节异常Wnt/β-catenin信号通路相关自噬和自噬基因Beclin 1,提高化疗药物对肿瘤细胞凋亡的敏感性提供了一种潜在的证据。