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炭疽是一种人畜共患的烈性传染病,其病原菌是炭疽芽孢杆菌。炭疽芽孢曾多次被用于生物恐怖袭击,也是潜在的生物战剂。深入认识炭疽芽孢杆菌的感染与致病机制,有助于炭疽预防与治疗新方法的发现,对维护生物安全有重要意义。炭疽芽孢杆菌的毒力因子主要包括荚膜和毒素。炭疽毒素包含三种蛋白质成分:保护性抗原（PA）,致死因子（LF）以及水肿因子（EF）。致死毒素（LT）由LF和PA构成,LF借助PA进入细胞,通过剪切丝裂原活化的蛋白激酶激酶（MAPKK）1-4、6和7而使相关通路失活。水肿毒素（ET）由EF与PA构成,EF借助PA进入细胞,能够剧烈升高细胞内cAMP水平,影响机体相关信号转导。以往对炭疽毒素的研究主要集中于LT,而对ET在炭疽感染和死亡中发挥的作用还不是十分了解。炭疽芽孢可以通过呼吸道、皮肤或消化道感染宿主。通过呼吸道进入体内的炭疽芽孢在被肺泡巨噬细胞吞噬后进入局部淋巴结,并萌发成繁殖体细菌。而在局部组织中萌发的炭疽芽孢,也能够利用炭疽毒素破坏天然免疫屏障而进入到局部淋巴结。巨噬细胞是天然免疫系统的关键成员之一,本研究针对ET对巨噬细胞功能的抑制作用及其分子机制进行了研究。首先在大肠杆菌中表达并纯化野生型炭疽水肿因子EF,及腺苷环化酶活性关键氨基酸残基突变的EF（H351R）和EF（H351A）。在体外非细胞反应体系和CHO-k1细胞中,野生型EF表现出极高cAMP生成效率,而EF（H351R）和EF（H351A）催化产生c AMP的效率大幅降低但仍有残留。在小鼠实验中,野生型或突变体EF与PA构成的ET、ET（H351R）和ET（H351A）能造成不同程度的器官损伤和局部水肿,损伤严重程度与组织内cAMP水平正相关。25-50μg的野生型ET可以造成小鼠死亡,而相同剂量的ET（H351R）或ET（H351A）对小鼠没有致死性。以小鼠单核巨噬细胞系RAW264.7作为细胞模型,对ET的作用效果进行评价。单核细胞成熟后可以分化成组织驻留表型和炎性表型两种不同的亚群。通过流式细胞术检测RAW264.7表面分子标志显示,在未经处理或LPS单独处理时细胞呈现CD14+CD16/32+的组织驻留表型,而ET与LPS共同刺激后这些细胞转变为CD14hiCD16/32-的表型。表达GFP蛋白的大肠杆菌能够被巨噬细胞吞噬,通过流式细胞术检测巨噬细胞的GFP阳性率及每个细胞中GFP荧光强度,能够反映巨噬细胞的吞噬功能和杀菌功能。结果显示,经ET预处理3h后的巨噬细胞吞噬功能没有下降,但是对胞内细菌的杀伤功能明显减弱。而对巨噬细胞分泌的细胞因子检测表明,ET处理下调了促炎细胞因子TNF-α和MCP-1的产生而上调了抑炎细胞因子IL-10和IL-6的产生。这些现象提示,ET处理使RAW264.7细胞向M2型分化。进一步利用新一代测序技术,对ET、ET（H351A）、腺苷酸环化酶激动剂Forskolin或PA处理后的RAW264.7细胞转录组进行了分析。相比PA处理组,ET、ET（H351A）和Forskolin处理分别使RAW264.7细胞产生了1228个、264个和211个基因表达上调或下调。对细胞内cAMP水平检测的结果显示cAMP水平升高与转录组差异程度具有正相关。从ET处理产生的差异基因筛选到了27个cAMP依赖基因,这些基因的功能主要与巨噬细胞免疫反应有关,而剩余的非cAMP依赖基因则主要参与细胞物质、能量代谢等功能。通过KEGG信号通路聚类分析ET处理产生的差异基因,发现TNF-α经过MAPK和NF-kB信号介导巨噬细胞活化这一途径中有较多差异基因富集。通过western-blot检测发现,ET处理抑制了MAPK蛋白家族成员ERK的磷酸化活化。而ET和ERK磷酸化抑制剂PD3125901处理RAW264.7细胞均能抑制细胞中TNF-α的转录活化与分泌。这提示,ET下调巨噬细胞TNF-α产生可能与ERK磷酸化抑制有关。ET处理还能抑制NF-kB结合位报告基因的活化以及下调TNF-α对NF-kB的激活。NF-kB抑制剂BAY 11-7082也能下调TNF-α基因启动子的活化。p65是最重要的NF-kB亚基。ET处理抑制了p65的磷酸化,减少了p65在细胞核中的定位。cAMP主要通过活化PKA发挥其活性。PKA抑制剂H89能够逆转ET对NF-kB转录活性的抑制。这些结果表明,ET可能通过PKA途径抑制p65介导的TNF-α转录活化。以上结果表明,ET可以通过抑制ERK和NF-kB活化,减少巨噬细胞的TNF-α产生。综上所述,本研究制备了野生型EF及其腺苷酸环化酶活性减弱的突变体EF（H351A）和EF（H351R）,发现了ET对于巨噬细胞表面分子标记改变和促炎功能的抑制;通过转录组测序,揭示了ET对巨噬细胞免疫功能的调控主要与其腺苷酸环化酶活性相关;进一步的分子机制研究表明,ET可能通过PKA途径抑制ERK和NF-kB活化,从而下调了巨噬细胞炎性因子TNF-α的产生。