在植物基因工程中，常借助高活性的组成型启动子驱动外源基因在转基因植物中高效表达。但是，外源基因在时间和空间上的持续性表达会增加细胞内物质和能量的负荷，从而影响转基因植物的生长与发育。采用组织特异性启动子就能够有效地控制外源基因在特定的组织或器官中表达，避免基因产物对受体生物及环境产生副作用。本文将柑桔种子球蛋白基因(citrin)5’端启动子不同长度的缺失片段与gus基因构建形成的融合载体，采用根癌农杆菌介导法(Agrobacterum-mediated)转入烟草优良品种的基因组中，获得了经分子生物学检测的转基因再生植株，并对转化群体中报告基因的表达模式进行了研究。这为研究citrin基因上游启动子的结构和功能间的相互关系奠定了基础，同时也为利用citrin基因启动子进行外源基因在转基因植物中的定位表达提供了理论依据。现将研究的主要工作和结果报道如下： 1．植物表达载体的获得 本实验室从柑桔优良品种“锦橙”中分离获得了约1.9kb种子球蛋白基因(citrin)上游调控区的片段，序列分析预测它是一个具有种子专一性表达的启动子。利用PCR技术进行缺失，构建得到了5个不同长度的5’端启动子缺失片段(pA-gus、pB-gus、pC-gus、pD-gus、pN-gus)与gus报告基因融合的植物表达载体及相应的根癌农杆菌菌株。 2．转基因烟草的获得 以烟草品种Wisconsin 38为试材，试管苗叶片为转化外植体，按照根癌农杆菌介导的烟草离体遗传转化操作程序，分别将citrin基因5’端启动子不同长度缺失片段与gus构建的融合基因导入到烟草的基因组中，并获得了经分子生物学检测的转基因再生植株及转基因群体。内容摘要 3.转基因烟草植株的生物学性状分析 根据所导入的启动子缺失片段的不同将已获得的转基因烟草植株分为A、B、C、D、N类群。观察发现，在自然生长状态下A、B、C、D类群的形态发育正常，而N类群植株普遍矮化，分枝数增，叶宽变小，营养生长期显著延长。转基因植株在形态和生长状态上的变化，可能与外源基因的导入及插入位点不同有关。 4.转基因烟草中报告基因表达部位及水平的检测 对转基因烟草的根、茎、叶、胚胎、胎座和种子等不同器官进行GUS的组织化学检测。结果表明，在导入pA一gus片段的转基因烟草中种子和胎座均呈现蓝色，其中仅有1株植株的根尖有极微弱的蓝色，而其他器官中未检测出GUS活性;导入较短片段pB一gus和pC一gus的转基因烟草中，叶片、种子等不同器官呈现出不同程度的蓝色:导入更短片段pD一gus和PN一gus的转基因烟草中，则在各种器官中均未检测到GUS活性。从而说明，citrin基因启动子具有驱动外源基因在种子和胎座中专一性表达的活性，是具有种子专一性表达的启动子。 对转基因烟草不同部位进行了GUS酶活性的荧光定量测定分析表明，导入启动子不同缺失片段的转基因烟草在不同部位的GUS酶活性水平存在差异。在根和茎中，Gus酶活性很低;而叶片中，导入较短片段pB一gus和pC一gus的转基因烟草的GUS酶活性明显增强，分别是阳性对照355启动子的2.7和3 .6倍;在种子中，导入pA一gus、pB一gus和pC一gus片段的转基因烟草的GUS酶活性分别是355启动子的4.5，4.3和3.5倍。因此可以进一步证实，citrin基因启动子是一种具有种子特异性表达功能的强启动子。 5.citrin基因启动子的生物信息学分析 根据生物信息学的原理，在网上利用数据库对citrin基因启动子序列进行了比对和分析。结果发现，citrin基因启动子除了具备真核生物经典启动子CAA’f-box和TATA一box的特征外，还具有决定其在种子或胚乳中特异表达以及信号诱导表达有关的顺式调控元件。根据启动子不同缺失片段驱动gus基因的表达情况可以进一步推测:GCN;、Prolamin一box和AACA基序这3个顺式作用元件对种子特异表达十分重要，GCN;基序可能决定基因的种子特异性表达，Prolamin一box和AACA基序具有协同作用，它们三者之间的共同作用对驱动基因的种子特异性表达至关重要。