近些年来，酶的催化多功能性的研究虽然得到了广泛的关注，但是目前为止还没有一个简单快速的方法来探究并说明酶的催化多功能性，而自然界中酶的数量是有限的，一些天然的酶对某些底物的活性又相对较低。因此，研究酶催化多功能性机制，并建立起有效的酶催化多功能性进化策略，不仅是蛋白质工程和生物工程中非常具有挑战性的工作，同时也是当今工业生产中亟需解决的问题。尤其是已经广泛的应用在工业上的酶。南极假丝酵母脂肪酶B（Candida antarctica lipase B, CalB）和其它的脂肪酶相比，具有非常多的优良特性，因此其受到了人们越来越多的重视。CalB从南极假丝酵母（Candida Antarctic）中提取出来的。由于CalB具有特殊的结构，使得它对非水溶性物质以及水溶性的物质都能具有相对较强的催化活性，CalB在水解反应以及有机合成反应中还具有非常高度的立体选择性。然而到目前为止，CalB在已发展成熟的高效表达系统中的重组表达量低，酶稳定性差且对于底物碳链较长的化合物的催化效率偏低，使得CalB在工业上的大规模应用受到限制。利用生物工程改造的方法对CalB进行定向改造，期望获得新型的对长短链底物化合物均具备较高活力的脂肪酶的同时还保留其稳定性，成为当今的热点之一。本论文中，我们以南极假丝酵母脂肪酶B（CalB）为探究对象，先对获得的重组菌株pET-22b-CalB-Rosetta (DE3)进行诱导条件的优化，获得了和其他课题组相比蛋白表达量相比提高了约10倍蛋白表达量的诱导表达条件。采用计算机分子模拟的方法将野生型CalB与不同类型底物分子对接，根据酶与底物的反应机理获得理想构象的对接产物，分析对接产物中酶与底物相互作用的主要氨基酸，同时测定这些氨基酸与活性中心距离，确定了突变的氨基酸位点。我们再根据CASTing方法将突变位点组合，突变组合为A(Thr138，Val139)，B (Ile189，Val190)，C (Leu278)，D (Ala281，Ala282)，E (Ile285)，设计NDT（双位点突变）和NNK（单位点突变）简并引物，采用重复饱和突变的方法对突变位点进行重复饱和突变，经过三轮突变我们获得了和野生型相比，对测活底物对硝基苯酚辛酸酯活性提高了大约10倍的突变菌株281F-282R/189I/138V-139C。对该突变体进行同源建模后，与底物对硝基苯酚辛酸酯对接，分析了突变体活性增高且稳定性不变的原因。我们猜测突变体稳定性不变而活性增高可能与蛋白分子内疏水相互作用有关，同时对对接的结果分析发现，提高活性中心氨基酸与底物间的疏水相互作用，疏水氨基酸与底物距离变近以及合适的区域口袋变大，都有可能提高酶对底物活性的同时不影响该酶的稳定性。本论文探究了活性中心区域进化对酶活性的影响，从计算生物学的角度分析了活性中心区域进化对酶活性以及稳定性影响的可能原因。探索了可能改变酶催化多功能性的研究策略。该研究有望为生物酶催化提供高活性及其稳定性的新酶源。