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目的:研究保肝宁对活化星状细胞HSC-T6增殖的影响;探讨保肝宁对cAMP反应序列结合蛋白(cAMP-responsiveelementbindingprotein,CREB)、核转录因子-κB(nucleartranscriptionalfactor-κB,NF-κB)、NF-κB抑制因子(inhibit-κB,IκB)以及Zf9的作用;研究保肝宁在HSC-T6对转化生长因子β(transforminggrowthfactorβ,TGF-β)的调节机制,试图阐明保肝宁抗肝纤维化的可能机制。
方法:一、体外实验:给正常Wistar大鼠随机分组,每组4只,采用血清药理学方法,分组给予保肝宁单倍剂量煎剂(1.215g/ml)、保肝宁二倍剂量煎剂(2.43g/m1)、秋水仙碱(0.027g/m1)和复方鳖甲软肝片(0.108g/m1)灌胃7天,阴性对照组大鼠给予生理盐水,常规方法制备含药血清及正常大鼠血清。将HSC-T6细胞传代培养,分组给予药物血清培养基及正常大鼠血清培养基培养细胞,采用甲基噻唑基四唑(methylthiazolyltetrazolium,MTT)比色法、蛋白质印迹法(WesternBlot)及凝胶阻滞实验(Electrophoreticmobility-shiftassay,EMSA)观察保肝宁对肝星状细胞(hepaticstellatecell,HSC)增殖的影响以及对HSC内CREB、NF-κB、IκB、Zf9以及TGF-β表达及活性的影响;
二、体内实验:牛血清白蛋白免疫攻击尾静脉注射制作大鼠免疫性肝纤维化模型,四组造模动物分别给予单倍剂量的保肝宁煎剂(保肝宁组)、二倍剂量的保肝宁煎剂(二倍保肝宁组)、生理盐水(模型组)和复方鳖甲软肝片(复方鳖甲软肝片组);另设正常培养的大鼠,尾静脉注射生理盐水,作为阴性对照组。应用苏木精和伊红(HaematoxylinEosin,HE)染色观察肝组织病理改变;检测大鼠血清透明质酸(Hyaluronicacid,HA)和谷丙转氨酶(alanineaminotransferase,ALT)含量;免疫组化法(Immunohistochemistry)观察肝脏内磷酸化-CREB的表达情况。
通过体内和体外实验探讨保肝宁对核转录因子CREB、NF-κB、IκB、Zf9以及炎症刺激因子TGF-β的调节作用,了解保肝宁抗肝纤维化的可能机制。
结果:一、与正常大鼠血清组相比,保肝宁组、两倍保肝宁组均能明显抑制HSC-T6细胞的增殖(P<0.01),复方鳖甲软肝片组、秋水仙碱组亦能抑制HSC-T6细胞的增殖(P<0.05);与复方鳖甲软肝片组、秋水仙碱组相比,保肝宁组、两倍保肝宁组明显抑制HSC-T6细胞的增殖(P<0.05),但保肝宁组与两倍保肝宁组间未见显著性差异(P>0.05)。
二、保肝宁作用10min后CREB磷酸化水平比正常血清组有较明显升高,30min达到最高水平,2、4hCREB磷酸化水平有所下降,至6h与正常血清组无显著差异,恢复至原来水平;而相同实验条件下保肝宁作用10min、30min、2h、4h、6h后,CREB蛋白水平保持恒定,与未加药组CREB蛋白水平相当,无明显差异;与正常组、复方鳖甲软肝片组、秋水仙碱组比较,保肝宁能明显提高CREB磷酸化水平;保肝宁作用不同时间后HSC内CREB与DNA结合水平保持不变,与正常血清组对照水平相当。
三、经保肝宁作用10min后IκB磷酸化水平比正常血清组有较明显降低,30min达到最低水平,2、4hIκB磷酸化水平有所上升,至6h与正常血清组无显著差异,恢复至原来水平;与正常组、秋水仙碱组比较,保肝宁组能明显降低IκB磷酸化水平;同时与正常血清组比较,保肝宁组NF-κB与DNA结合水平明显下降。
四、与正常血清组、秋水仙碱组比较,保肝宁组Zf9与DNA结合水平明显下降;同时保肝宁组TGF-β1水平比正常血清组、秋水仙碱组有明显降低。五、牛血清白蛋白免疫攻击造成的免疫性肝纤维化大鼠模型经不同药物处理后,根据肝纤维化分级比较,与正常组相比,模型组、保肝宁组和复方鳖甲软肝片组肝纤维化程度增加,其差异有显著性意义(P<0.01),与模型组相比,保肝宁组和复方鳖甲软肝片组肝纤维化程度显著降低,其差异有显著性意义(P<0.05),二倍保肝宁组肝纤维化程度降低更显著(P<0.01);保肝宁组与复方鳖甲软肝片组相比,肝纤维化程度表达差异无显著性意义(P>0.05),保肝宁组与二倍保肝宁组之间比较亦无显著性差异(P>0.05)。与正常组比较,模型组、复方鳖甲软肝片组血清ALT、HA表达显著性增高,其差异有显著性意义(P<0.01),保肝宁组与二倍保肝宁组亦有所增高(P<0.05);与模型组比较,保肝宁组和复方鳖甲软肝片组血清ALT、HA表达显著降低,其差异有显著性意义(P<0.01),与保肝宁组比较,复方鳖甲软肝片组血清ALT、HA表达显著性增高,其差异有显著性意义(P<0.05),但保肝宁组与二倍保肝宁组之间比较无显著性差异(P>0.05)。
六、免疫组化结果显示:与正常组比较,模型组磷酸化-CREB表达显著性降低,其差异有显著性意义(P<0.05),保肝宁组与二倍保肝宁组磷酸化-CREB表达显著性增高(P<0.05及P<0.01),而复方鳖甲软肝片组磷酸化-CREB表达没有显著性差异(P>0.05);与模型组比较,保肝宁组和二倍保肝宁组磷酸化-CREB表达显著增高,其差异有显著性意义(P<0.01),复方鳖甲软肝片组表达亦增高(P<0.05)。与复方鳖甲软肝片组比较,保肝宁组磷酸化-CREB表达显著增高(P<0.05)。
结论:一、保肝宁抑制HSC的增殖;
二、保肝宁促进HSC-T6细胞磷酸化-CREB的表达,可能是保肝宁抑制HSC增殖的机理之一;
三、保肝宁抑制HSC-T6细胞IκB磷酸化的表达,同时还可抑制NF-κB的转录活性,可能是保肝宁抑制HSC增殖的机理之一;
四、保肝宁很可能能够通过抑制Zf9的转录活性而抑制炎症刺激因子TGFβl的表达,最终抑制HSC的增殖;
五、保肝宁能明显降低免疫性肝纤维化血清HA和ALT水平,减轻肝纤维组织增生程度。